Implicancia de Ca y especies activas de oxígeno en la manifestación de "tipburn" en lechuga bajo condiciones de salinidad

Ing. Agr. Luciano Raúl Carassay

TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES
UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA
Córdoba, Argentina
2012
Directora: Dra. Edith L. Taleisnik
Co-Director: Dr. Alberto D. Golberg

Carassay, Luciano Raúl

Implicancia de Ca y especies activas de oxígeno en la manifestación de Tipburn en lechuga bajo condiciones de salinidad / Luciano Raúl Carassay. - 1a ed . - Santa Rosa : Universidad Nacional de La Pampa, 2017.

Libro digital, EPUB - (Publicación de tesis de grado, maestría, doctorado y trabajos finales de especialización ; 1)

Archivo Digital: online
ISBN 978-950-863-292-0

1. Agricultura Familiar de la Región Pampeana. I. Título. CDD 630.1

Comisión Asesora

Dra. Edith L. Taleisnik
Investigadora de CONICET, IFFIVE, INTA
Dra. María Elena Alvarez
Investigadora de CONICET- Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba
Dr. Claudio Alejandro González, Cátedra de Fisiología Vegetal, Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, Universidad Nacional de Córdoba

Dedicatoria

A mi esposa Carola que me acompaño en todo momento y a mi otro amor la pequeña Josefina. Sin ellas no disfrutaría de mis logros.

A mi querida familia, a mi madre Alicia y a mis hermanas: Celeste y María Belén y a mis pequeños sobrinos.

En especial a mi abuelo Abel Ragni, que lo tengo presente en todo momento y fue la persona que constantemente me aconsejó en lo importante que es el estudio.

A mi madre María y al Señor Jesucristo.

Agradecimientos

A mi querida Facultad de Agronomía (UNLPam) y al INTA-IFFIVE por proveer el espacio y el equipamiento con el que se realizaron la mayoría de los experimentos. Al CONICET, por el apoyo financiero a través de la beca doctoral.

A las autoridades de la Facultad de Agronomía que se desempeñaron durante mi formación doctoral, el apoyado institucional fue fundamental para desempeñar mi trabajo de tesis.

Un especial agradecimiento a mis directores Edith y Alberto, por sus aportes en mi formación académica, profesionalismo y calidad personal.

A los miembros de la comisión asesora y evaluadores de esta tesis.

A mis compañeros de trabajo de la Facultad de Agronomía especialmente a aquellos con los que compartí buenos momentos y a los que aportaron un granito de arena para mi tesis, en especial para Mabel, Darío, Mario, Alicia, Lía, Marita, Raúl, Horacio, Oscar, Claudia, Daniel, Ernesto, Sosa, Carlos, Teresa, Nilda, Ana, Estela, Olga, Abel, Elke, Sergio, Mariana, Dori, Alejandra, Juan de Dios y Juan Colazo. A mis compañeros de Horticultura, que aguantaron mi ausencia en la Cátedra durante mi formación doctoral.

A todos los que me albergaron en mis estadías en Córdoba, fue una ayuda muy importante, gracias Loli, Gastón, Pablo, Carlitos, también al área de la juventud del Gobierno de La Pampa por posibilitar la estadía en la Casa de la La Pampa en Córdoba.

A la gente del INTA-IFFIVE, especialmente a Loli, Alicia, Euge, Leo, Pablo, Rodrigo, Nacira, Paola, Dani, por sus asistencias en los aspectos académicos, en las mediciones y principalmente en la contención afectiva, amistad, buena onda y ánimo constante.

A Marisol, Lucrecia, Laura y Javier del Laboratorio de Biocatálisis de la Facultad de Exactas y Naturales de la UNLPam.

Muchas gracias a todos.

Publicación con referato

Luciano R. Carassay; D. A. Bustos; A. D. Golberg; E. L. Taleisnik. 2012. Tipburn in salt-affected lettuce (Lactuca sativa L.) plants results from local oxidative stress. Journal of Plant Physiology. 169(3): 285-293.

Capítulo de libro

Luciano R. Carassay; D. A. Bustos; A. D. Golberg; E. L. Taleisnik. 2010. Implicancia del Ca²⁺ y la actividad antioxidante en la manifestación de tipburn en lechuga (Lactuca sativa L.). Encuentros Binacionales de Jóvenes investigadores del Bicentenario Argentino-Chileno. Secretaría de Políticas Universitarias de la República Argentina. ISBN: (en trámite) Tomo 1, págs. 363-369.

Lista de abreviaturas

AOs: amino oxidasas
APX: ascorbato peroxidasa
BER: blossom end rot
BSA: albúmina bovina sérica
CAT: catalasa
CE: conductividad eléctrica
DHAR: dehidroascorbato reductasa
Di: Divina
DMC: daño de membranas celulares
DO: densidad óptica
DPI: difeniliodonio
dS: decisiemens
EGTA: ethylene glicol-bis (beta-aminoethyl ether) tetraacetic acid
EROs: especies reactivas del oxígeno
GD: grados día
GR: glutation reductasa
IT: índice de tipburn
LPI: índice de plastocrono foliar
mA: miliamper
MDA: malondialdehído
MDHAR: monodehidroascorbato reductasa
NADPH: nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
NBT: azul de tetrazolio (nitro blue tetrazolium)
NOX: familia de NADPH oxidasas
PAOs: enzimas poliaminas oxidasas
PI: índice de plastocrono
Po: Pontina
Pr: Prima
PSI: fotosistema uno
PSII: fotosistema dos
PSI: porcentaje de sodio intercambiable
PUFAs: ácidos grasos poliinsaturados
PVP: polivinilpirrolidona
RAS: relación de absorción de sodio
ROC: receptor-operated channels
ROS: reactive oxygen species
SMOC: second messenger-operated channels
SOC: store-operated channels
SOD: superóxido dismutasa
Su: Sunstar
TBA: tiobarbitúrico
TCA: tricloroacético
TEFR: tasa de elongación foliar relativa
TER: tasa de expansión foliar relativa
TEMED: tetramethylethylenediamine
TSD: total de sales disueltas
VOC: voltage-operated channels

Resumen

El tipburn es una enfermedad atribuida a deficiencias de Ca²⁺ durante un activo crecimiento foliar, y vinculado con la salinidad. El objetivo del trabajo fue analizar el vínculo entre tipburn y el crecimiento, el suministro de Ca²⁺, y las especies activas de oxígeno (EROs). Se evaluaron cuatro genotipos de lechuga: Pontina, Sunstar, Prima y Divina, cultivadas en hidroponía con el agregado de NaCl, NaHCO₃ o la combinación de ambas, y con suministro normal o reducido de Ca²⁺. Ambas sales promovieron la aparición de tipburn, la baja disponibilidad de Ca²⁺ incrementó su incidencia, pero el NaHCO₃ originó además síntomas de toxicidad y clorosis. Pontina no expresó tipburn en ninguna de estas condiciones. La expresión del tipburn fue modulada por aplicaciones foliares tópicas de un quelante de Ca²⁺ (EGTA), inhibidores del transporte de Ca²⁺ (verapamil y LaCll₃), el ionóforo (A.23187), y los antioxidante tiron y DPI. Se determinó la presencia de EROs, peroxidación de lípidos, daño a membranas celulares y actividad de las enzimas antioxidantes SOD, CAT y APX. El secuestro localizado de Ca²⁺ originó estrés oxidativo y tipburn en las regiones tratadas, incluso en Pontina, mientras que la aplicación de antioxidantes y el incremento en el suministro local de Ca²⁺ impidieron la manifestación de síntomas. Por lo tanto, el tipburn se asoció con alteraciones en el suministro de calcio y con incremento en EROs, que ocasionaron estrés oxidativo. Se observó menos estrés oxidativo, y mayor respuesta en la actividad SOD en Pontina que en Sunstar, aspectos que se sugiere están vinculados con la tolerancia al tipburn en la primera.

Abstract

Tipburn in lettuce is a physiological disorder expressed as a necrosis in the margins of young developing leaves and is commonly observed under saline conditions. Tipburn is usually attributed to Ca²⁺ deficiencies, in actively growing leaves. This work examined whether symptoms are mediated by increased ROS production. Four lettuce varieties were grown in hydroponics with normal (2.5 mM), low Ca²⁺ (0.5 mM), and with or without 50 mM NaCl, NaHCO₃ or both. Symptoms were observed consistently in Sunstar, and only in the saline treatment, while Pontina never showed them. Treatments with NaHCO₃ induced toxicity symptoms. Tipburn incidence in response to topical treatments with Ca²⁺ scavengers, Ca²⁺ transport inhibitors, and antioxidants was assessed. All treatments were applied before symptom expression, and evaluated later, when symptoms were expected to occur. Superoxide presence in tissues was determined with NBT and oxidative damage as malondialdehyde content. SOD, CAT and APX activities were assayed. Under control and saline conditions, tipburn could be induced in both varieties by topical treatments with a Ca²⁺ scavenger (EGTA) and Ca²⁺ transport inhibitors (verapamil, LaCll₃) and reduced by supplying Ca²⁺ along with a ionophore (A.23187). Tipburn symptoms were associated with locally produced ROS. O₂.- and oxidative damage significantly increased in leaf margins before symptom expression, while topical antioxidant applications (tiron, DPI) reduced symptoms in treated leaves, but not in the rest of the plant. Antioxidant enzyme activity was higher in Pontina, and increased more in response to EGTA treatments, and may contribute to mitigating oxidative damage and tipburn expression in this variety.

Capítulo I

Introducción General

1.1. El cultivo de lechuga en la provincia de La Pampa

La lechuga (Lactuca sativa L.) pertenece a la familia Asteraceae, subfamilia Cichorioideae, el género Lactuca comprende alrededor de 100 especies (Lebeda et al., 2007). Es una planta anual, herbácea, posee látex (en latín la palabra lac significa látex). Presenta hojas alternas espatuladas, planas o circulares en bordes lisos, ondulados o dentados (crespos), el color varía entre el verde claro-amarillento hasta el verde oscuro y rojizo y por su consistencia pueden ser rígidas o tiernas (Mantecosas) (Ryder, 1986). La raíz es pivotante y muy ramificada, crecen cerca de la superficie del suelo (20-30 cm). El tallo es corto en la etapa vegetativa (1 a 3 cm), cuando es estimulada la floración los entrenudos se alargan pudiendo alcanzar una altura de 1,5 m. Las flores se encuentran agrupadas en capítulos de 13 a 30 flores y presentan auto-polinización (Di Benedetto, 2005).

El cultivo se remonta a la época de los Romanos y de los Griegos (2300 a.c.) (Balcaza, 2010). La lechuga es una de las especies hortícolas más importantes en de la Argentina (Grazia et al., 2001) con una producción de 320.000 tn/año y un consumo de 21 kg/hab./año (Fuente: Corporación del Mercado Central de Buenos Aires 2004). En el mundo es la hortaliza que ocupa el tercer lugar en importancia, por su producción y consumo (Ehret y Ho, 1986).

Según encuestas del Ministerio de la Producción de La Pampa realizadas durante el año 2007, el 59 % de la superficie bajo cubierta en la provincia lo ocupa el cultivo de lechuga. No existen datos oficiales de producción total, debido a que no hay un mercado concentrador y las ventas se realizan en el circuito informal como ocurre en la mayor parte del territorio argentino (Ottone, 2009). La producción de lechuga se realiza normalmente en invernaderos del tipo “macrotúnel” que ocupan una superficie de 300-420 m². Dependiendo de la variedad y la época, el rendimiento promedio en invernadero es de 2,5 kg∙m² (Grégoire et al., 2001), cuando se produce eficientemente se realizan hasta 7-7,5 ciclos anuales, los promedios de producción estimados son de 215 tn/ha/año.

En la provincia de La Pampa las dos variedades botánicas que se producen son Lactuca sativa var. crispa ó intybacea: llamada “lechuga crespa”, caracterizada por no formar cabeza, tiene hojas anchas con márgenes dentados o crespos, sueltas y dispersas; y Lactuca sativa var. capitata, en esta variedad existen varios tipos que se caracterizan por formar una cabeza compacta, en La Pampa se cultiva la del tipo “mantecosa” que posee la particularidad de no formar “cabeza” y elevada calidad culinaria. Ambas variedades botánicas se cultivan en similar proporción y existen gran número de variedades comerciales que cambian cada 2 o 3 años, a causa de que son abastecidas por los importadores de semillas según la oferta internacional.

En los sistemas comerciales de producción, se observa frecuentemente la aparición de la enfermedad fisiológica denominada “quemado del borde” o “tipburn”.

1.2. ¿Qué es el tipburn?

El tipburn es el nombre de una necrosis que se manifiesta en el margen de las hojas de lechuga, y es considerado como la enfermedad de origen abiótico más importante de la especie (Misaghi et al., 1992). El tipburn afecta negativamente la calidad y vida útil del producto (Hayes, 2006), y causa importantes pérdidas económicas en todo el mundo (Misaghi et al., 1981). En Argentina, al momento de la comercialización, la presencia de tipburn en los bordes de las hojas puede ser motivo de descarte en el mercado concentrador originando una pérdida total y si el producto llega a ser comercializado se lo clasifica como de “calidad comercial”, disminuyendo el precio, con respecto al de “calidad superior” alrededor de un 25 % en invierno o del 50 % en verano (Fuente: Corporación del Mercado Central de Buenos Aires 2011).

El tipo de necrosis que se denomina tipburn es diverso, genéricamente se distinguen: 1- la necrosis seca o “dry tipburn” que ocurre simultáneamente en todas las plantas durante la época estival (Alvarado et al., 2001); 2- necrosis húmeda o “normal tipburn”, es la más común y se localiza usualmente en las hojas internas dentro de la estructura denominada “cabeza” donde se pueden observar sobre los bordes del limbo pequeñas manchas translúcidas que oscurecen luego dando nacimiento a una podredumbre blanda (Thicöipé, 1997; Balcaza, 2006); y 3- necrosis del látex o “latex tipburn”, es una necrosis seca que se desencadena por la ruptura de canales laticíferos en el borde de las hojas durante su crecimiento, por debilitación de las paredes celulares causadas por un déficit en el suministro de calcio (Thicöipé, 1997).

1.3. Asociación entre tipburn, déficit de Ca²⁺ y crecimiento

El tipburn es atribuido generalmente a deficiencias de Ca²⁺ en hojas jóvenes en activo crecimiento (Collier y Tibbitts, 1982), habiéndose descripto una correlación negativa entre la incidencia de tipburn con el contenido de Ca²⁺ (Yanagi et al., 1983) y la distribución foliar de este elemento (Barta y Tibbitts, 1991; Barta y Tibbitts, 2000). No obstante, se observó que la incidencia del tipburn se mantuvo baja durante los meses de invierno, incluso con muy bajos niveles de Ca²⁺ en la planta.

El tipbun en lechuga es vinculado con enfermedades de otras hortalizas, debido a que comparten un origen en común, que es la deficiencia de Ca²⁺. Algunos ejemplos son el tipburn en endibia (Cichorium endivia L.) (Tzortzakis, 2008) y escarola (Cichorium endivia var. crispum) (Maynard, 1979), el corazón negro en repollo (Brassica oleracea L. var. capitata) (Tibbitts y Palzkill, 1979), repollo chino (Brassica campestris susp. pekinensis LO) (Aloni, 1986) y repollo de Bruselas (Brassica oleracea var. gemmifera DC.), coliflor (Brassica oleracea var. botrytis) (Rosen, 1990) y corazón negro en apio (Apium graveolens L.) (De Pascale y Barbieri, 1995). Los autores coinciden en que las enfermedades fisiológicas mencionadas se relacionan con una deficiencia de Ca²⁺, debido a que este catión no puede ser movilizado desde los tejidos más viejos del vegetal, ni ser redistribuidos por la vía floemática, obligando a los tejidos en desarrollo a depender del suministro inmediato del Ca²⁺ a través del xilema (White y Broadley, 2003). Otro vínculo en común es que las deficiencias de Ca2+ ocurren en hojas y tejidos jóvenes en activo crecimiento (Collier y Tibbitts, 1982) y la incidencia al tipburn en las hojas está asociada negativamente con el contenido y distribución del Ca2+ (Saure, 1998). En tal sentido se lo ha relacionado con la podredumbre basal (blossom end rot, BER) en tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) (Saure, 2001) y pimiento (Capsicum annuum L.) (Aktas et al., 2003) en las que la disponibilidad de Ca²⁺ juega un papel importante en el crecimiento durante la rápida expansión celular en la zona distal de fruto, si estas células no tienen suficiente Ca²⁺ disponible ocurre una ruptura e incremento en la permeabilidad de la membrana celular (con una importante pérdida de iones), y posteriormente se produce la muerte celular dando lugar a la manifestación del BER (Saure, 2001). La podredumbre basal puede verse afectada por diversos factores ambientales y metabólicos, en particular las interacciones entre el Ca²⁺ y otros nutrientes (N, K y P), hormonales (auxinas y giberelinas) y condiciones de estrés (térmico, hídrico, salino, oxidativo, etc.) (Aktas et al., 2005).

En contraposición a lo anterior, Wissemeier (1996) y Holtschulze (2005) no encontraron correlación entre la incidencia del tipburn y el contenido de Ca²⁺ de las hojas, e incluso en los márgenes de las hojas; estos autores no hallaron diferencias en la incidencia del tipburn dentro de un cultivar o entre diferentes cultivares evaluados, afirmando que el tipburn no puede ser explicado por diferencias en el contenido de Ca²⁺. En consecuencia, el tipburn no puede predecirse en base al contenido de Ca²⁺ (Rosen, 1990; Wissemeier, 1996; Pereira et al., 2005). Borkowski y Ostrzycka (1973) plantearon una misma técnica de fertilización para evitar el BER en tomate y el tipburn en lechuga, aunque las enfermedades descriptas precedentemente tienen un vínculo en común en relación a la deficiencia del Ca²⁺, pero son distintas las condiciones de estrés que originan la enfermedad (Saure, 1998; Saure, 2001; Rubio et al., 2009).

Por otra parte, diversos autores indicaron que el desarrollo del tipburn en lechuga no sólo depende del contenido de Ca²⁺ en las hojas, sino también de las tasas de crecimiento de las hojas individuales y de partes de las mismas, es decir, depende de la oferta relativa de Ca²⁺ en relación con la tasa de crecimiento de las hojas (Maynard y Barker, 1972; Collier y Huntington, 1983), y la incidencia del tipburn aumenta cuando incrementan las tasas de crecimiento en hojas (Saure, 1998). De hecho, el tipburn se manifiesta inicialmente cuando las hojas se encuentran en la fase de expansión celular (Wissemeier, 1996). En plantas que tienen un crecimiento acelerado, el balance entre la parte aérea y las raíces se traduce en una mayor relación tallo/raíz disminuyendo la absorción de agua y del Ca²⁺ (Brumm, 1992). En lechuga cultivada a campo, el tipburn aparece en la mayoría de los casos poco tiempo antes de la cosecha, sobre todo, en aquellas hojas o partes de las hojas que se expandieron más rápidamente (Collier y Huntington, 1983). Esto concuerda con los hallazgos de Maynard y Barker (1972) en coles de Bruselas donde bajos niveles de Ca²⁺ no causaron pardeamiento interno, un trastorno relacionado al tipburn (Saure, 1998), a menos que estuvieran combinados con un rápido crecimiento. Estas observaciones indican que un rápido crecimiento puede aumentar la susceptibilidad al tipburn.

1.4. Tipburn y factores ambientales que alteran el crecimiento

Se ha observado una alta correlación entre el incremento de la radiación en verano, durante las 3-4 semanas previas a la cosecha con un aumento en la severidad del tipburn (Wissemeier y Zuhlke, 2002). También se observó que si la alta intensidad de luz es acompañada de un incremento del fotoperíodo, aumenta la incidencia y la velocidad de aparición y desarrollo del tipburn (Tibbitts y Rao, 1968; Cox et al., 1976). La incidencia relacionada con mayores períodos de luminosidad fue asociada con altas tasas de crecimiento que originaron un incremento en la demanda de calcio (Kleemann, 2000).

El nitrógeno, principalmente el amoniacal, compite con el ingreso del Ca²⁺ desde las raíces al interior de la planta (Saure, 2001; Ho y White, 2005), y su suministro incrementó la incidencia del tipburn en comparación al nitrógeno aplicado en forma de nitrato; se observó en plantas fertilizadas con NH₄⁺ una reducción en la captación de Ca²⁺ y Mg²⁺, y el contenido de estos nutrientes en los tejidos fue menor que en las plantas fertilizadas con NO₃- (Claassen y Wilcox, 1974). La mayor incidencia del tipburn a causa de la fertilización nitrogenada fue al inicio de la formación de la cabeza y durante las semanas previas a la cosecha (Imai, 1987; Brumm et al., 1993).

Se relacionó también al tipburn con altas temperaturas registradas durante el ciclo del cultivo (Misagui y Grogan, 1978), es por esa razón que usualmente es llamado “quemado del borde”, siendo un problema habitual en zonas cálidas y en la estación de verano. En plantas creciendo en invernadero también se describió un incremento en la severidad del tipburn con altas temperaturas y humedad (Barta y Tibbitts, 2000) y en condiciones controladas (Thompson, 1926). Cox et al. (1976) describieron una correlación directa entre la temperatura y el tipburn en lechuga, creciendo con una iluminación constante, sin embargo sugirieron que la temperatura por si sola no es el único factor que indujo el tipburn.

La necrosis seca (dry tipburn) se observa a veces al final del ciclo; cuando la demanda de agua por parte de la atmósfera es mayor que el suministro por las raíces (Alvarado et al., 2001). No obstante, también puede ocurrir tipburn en condiciones de alta humedad atmosférica cuando el gradiente de presión de vapor es bajo, en tales condiciones se restringe la corriente transpiratoria y por ende, el transporte de Ca²⁺ (Thicöipé, 1997; Balcaza, 2006). La alta humedad relativa puede interferir directamente con la distribución del Ca²⁺ y ocasionar tipburn en repollo y lechuga (Collier y Tibbits 1984). Por otra parte, la necrosis húmeda (“normal tipburn”), se observó en ocasiones cuando un período de insolación siguió a otro nublado, sobre todo si el suelo estuvo seco y con una alta salinidad (Thicöipé, 1997; Balcaza, 2006). La necrosis del látex (latex tipburn), se produce principalmente por el cambio climático durante la primavera o en el verano (Thicöipé, 1997).

El tipburn también se asoció a condiciones de estrés durante el crecimiento de la planta (Jenni y Yan, 2009), tales como sequía temporaria, especialmente si el cultivo se encontraba con buena disponibilidad hídrica (Saure, 1998), ya que la distribución del Ca²⁺ se encuentra estrechamente ligados al flujo hídrico (Guillihan et al., 2011). En suelos donde existió un pobre drenaje y compactación también se incrementó la incidencia del tipburn (Aloni, 1986).

Existe una estrecha relación entre el tipburn y la salinidad del suelo (Sonneveld y Mook, 1983; De Pascale y Barbieri, 1995; Saure, 1998). A nivel general, y por convención se considera que un suelo salino es el que posee una conductividad eléctrica en el extracto de saturación del suelo igual o mayor a 4 dS∙m-1 (Rhoades et al., 1989), pero el efecto de la salinidad en las plantas depende de las condiciones climáticas, edáficas y las prácticas culturales. Usualmente se relaciona al estrés salino con una reducción en el rendimiento (Mass, 1986). El Na⁺ afecta la permeabilidad, la estructura y la infiltración del agua en el suelo (Balcaza, 2003), estas causas predisponen la aparición del tipburn (Sonneveld y Mook, 1983), situación que ocurre con frecuencia en los cultivos de lechuga en La Pampa a partir de la primavera temprana. De Pascale y Barbieri (1995) describieron una mayor incidencia del tipburn a medida que incrementó el Na⁺ en el agua de riego y una disminución de la fotosíntesis neta, la tasa transpiratoria y la conductancia estomática. Por otra parte se ha vinculado la acumulación del Na⁺ en láminas foliares con la muerte de tejidos (Hernández et al., 1995), por lo que un incremento de Na⁺ foliar podría generar la muerte celular que origina las necrosis características del tipburn. Además, el K⁺ tiende a ser reemplazado por el Na⁺ cuando este último está en exceso. En tomate (Taleisnik y Grunberg, 1994) y trigo (James et al., 2006; Munns, et al., 2006) han propuesto que una mayor relación K⁺/Na⁺ es un indicio de tolerancia a la salinidad. La lechuga es poco tolerante a la salinidad (Mass, 1986), característica que podría estar vinculada a la predisposición al tipburn.

Como se describió, el tipburn también se asocia conceptualmente al BER, que es promovido, por una parte, por factores ambientales como la alta luminosidad y la elevada temperatura, que aceleran el crecimiento del fruto, y por otra, por los que reducen la captación, el transporte y la partición de Ca²⁺ en el fruto, situación que es frecuente en presencia de salinidad en el sustrato (Ho y White, 2005; Rubio et al., 2009).

1.5. Dinámica del Ca²⁺ en la célula y su vinculación con las especies reactivas del oxígeno (EROs)

El Ca²⁺ está localizado mayoritariamente en paredes celulares, también en membranas (Marschner, 1995), y es un componente común en cadenas de transducción de señales, por lo que su concentración citosólica está ajustadamente regulada por mecanismos de flujo transmembranal y compartimentalización intracelular. El pasaje transmembranal de Ca²⁺ opera a través de diversos tipos de canales (White y Broadley, 2003), que pueden ser activados por hiperpolarización, despolarización de las membranas celulares o ser independientes del voltaje. La actividad de los primeros (hyperporalization-activacted Ca²⁺ channels HACCs) se ha vinculado específicamente a la expansión celular (Foreman et al., 2003), y es promovida por la presencia de especies reactivas de oxigeno (EROs).

Las EROs, anión radical superóxido (O₂.- ), peróxido de hidrógeno (H₂O₂), radical hidroxilo (.OH) y oxígeno singulete (¹O₂), se generan como parte del metabolismo aeróbico normal en diversos compartimientos celulares por ejemplo en cloroplastos (en fotosíntesis, la imposibilidad de canalizar los electrones excitados hace que estos sean aceptados por el oxígeno, lo que lleva a la producción de O₂.-, .O₂ y H₂O₂), también en mitocondrias, peroxisomas, citoplasma, e incluso en el apoplasto (Mittler et al., 2004; Bowler y Fluhr, 2000), donde son producto, entre otros mecanismos, de la actividad de la NADPH oxidasa de membrana (Ogawa et al., 1997).

Las EROs participan en las cascadas de señalización celular y en la modulación de respuestas que abarcan desde la defensa al estrés biótico y abiótico (Munns y Tester, 2008) hasta la muerte celular programada (Bais et al., 2003). Las EROs apoplásticas están implicadas en la regulación de la expansión celular por el control de la actividad de los canales de Ca²⁺ (Foreman et al., 2003) y por efectos sobre las propiedades reológicas de las paredes celulares (Cosgrove, 1999), al participar tanto en su aflojamiento (Fry et al., 2001; Schopfer et al., 2001) como en su rigidización (Ogawa et al., 1997). En la zona en expansión de láminas foliares de maíz, la salinidad redujo el crecimiento y la concentración de EROs (Rodríguez et al., 2002) y la adición externa de EROs pudo mitigar la reducción de la elongación provocada por NaCl. Tales efectos se vincularon a la acción del NaCl sobre la actividad de la NADPH oxidasa de membrana (Rodríguez et al., 2007).

Recientemente, se ha relacionado la podredumbre basal en pimiento y tomate (BER), en condiciones de salinidad, con la producción de EROs en hojas y zonas del fruto afectadas debido a que la salinidad incrementó la actividad de la NADPH oxidasa en las células del pericarpio (Aktas et al., 2005). En la literatura no se registran datos sobre la asociación entre el daño oxidativo y el tipburn en lechuga.

1.6. Tipburn y EROs

Los antecedentes citados precedentemente permiten vincular el tipburn, la expansión foliar, el metabolismo del Ca²⁺ y las EROs. El tipburn podría generarse por deficiencia de Ca²⁺ en células en expansión, como consecuencia del déficit en el suministro y/o en alteraciones del ingreso de Ca²⁺ a las células. Una disminución en la producción de EROs en las células en expansión, por efecto de la salinidad, como se ha visto en maíz (Rodríguez et al., 2004), podría generar tal efecto.

Las EROs causan la peroxidación de lípidos de las membranas celulares (Chen et al., 2000), con la consecuente pérdida de su selectividad y deterioro, las EROs en exceso también originan la desnaturalización de proteínas (Jiang y Zhang, 2001) y daño en los ácidos nucleicos (Hagar et al., 1996). Se ha vinculado la acumulación de Na⁺ en láminas con el incremento de EROs (Hernández et al., 1995); el tejido dañado con EROs suele mostrar oxidaciones y posterior muerte celular, tal como se ha observado en hojas de arvejas de cultivares susceptibles a la salinidad (Hernández et al., 2001).

El secuestro o metabolización de las EROs juega un papel fundamental en la tolerancia al estrés oxidativo, y en condiciones de estrés salino la habilidad de las plantas en destoxificarlas es probablemente uno de los requerimientos mas relevantes (Parida y Das, 2005). Una manera de mitigar las EROs en las células, es por la actividad de las enzimas antioxidantes (Rivero et al., 2007). Entre las enzimas que participan en las defensas antioxidantes, cabe mencionar la denominada superóxido dismutasa (SOD) cuya función es acelerar la reacción de dismutación del O₂.-; la ascorbato peroxidasa (APX) y la catalasa (CAT) que eliminan el H₂O₂ (Nakano y Asada, 1981) y la Glutation reductasa (GR) (Mhamdi et al., 2010) entre otras. También existen antioxidantes no enzimáticos como: el ascorbato, glutatión, tocoferol, carotenoides, flavonoides (Fazeli et al., 2007), prolina (Piqueras et al., 1996; Matysik et al., 2002), azúcares como la sacarosa y metales de transición como Mn, Zn, Fe y Cu que actúan directamente en el metabolismo de defensa o como cofactores enzimáticos en los procesos de óxido-reducción (Tan et al., 2010).

Las enzimas antioxidantes mitigan el daño oxidativo en condiciones de estrés salino (Han y Lee, 2005), y pueden participar en la tolerancia al estrés oxidativo originado por EROs como se observó en plantas de arveja (Hernández et al., 2000; Hernández et al., 2001). Las EROs pueden activar vías de detoxificación promoviendo la síntesis de enzimas antioxidantes (Gueta-Dahan et al., 1997). La actividad de estas enzimas podría tener un papel fundamental en la tolerancia al tipburn, si existiera una relación entre la producción de EROs y la manifestación de los síntomas.

Los antecedentes citados llevan al planteo de las hipótesis que se enuncian más abajo, en el marco del objetivo general del trabajo que fue aportar conocimiento acerca de las causas fisiológicas del tipburn asociadas a la salinidad en lechuga.

1.7. Hipótesis y objetivos del estudio

En plantas de lechuga…

Condiciones de salinidad y alcalinidad incrementarán la incidencia del tipburn, y en lechuga la tolerancia a la salinidad medida como respuesta relativa de crecimiento, está positivamente correlacionada con la tolerancia al tipburn.

El tipburn se manifiesta en hojas en activo crecimiento, por ende, la modificación de las tasas de crecimiento modificarán la expresión del tipburn.

El tipburn se asocia a alteraciones en la distribución/suministro de Ca²⁺ (y otros iones) en la hoja. Por lo tanto, la manipulación de la concentración local de Ca²⁺ mediante el suministro o el secuestro, disminuirá o incrementará respectivamente la expresión del tipburn.

La manifestación de tipburn se incrementará en función de la acumulación foliar de Na⁺.

La manifestación de tipburn resulta de la presencia de EROs en láminas foliares,

Apoplásticas, involucradas en el control del crecimiento celular e ingreso de Ca²⁺ (en células en crecimiento) o bien simplásticas o apoplásticas, que generan estrés oxidativo (en células expandidas y en crecimiento).

Variedades con diversa susceptibilidad a tipburn diferirán en el control enzimático del estrés oxidativo: habrá menor expresión de tipburn en variedades con mayor actividad antioxidante.

Objetivos

Identificar variedades que muestren respuestas contrastantes respecto de la incidencia del tipburn en condiciones de salinidad y alcalinidad, y verificar su asociación con la tolerancia a la salinidad.

Determinar patrón de crecimiento de hojas, identificar las regiones en activo crecimiento y verificar su asociación con la manifestación del tipburn.

Modificar la concentración local de Ca²⁺ mediante aumentos en el suministro o secuestro por quelantes, modular su ingreso al citosol por modificación farmacológica de la apertura de canales específicos; para determinar si los síntomas de tipburn están relacionados con la modificación de la concentración local del Ca²⁺.

Determinar el patrón de producción de superóxido en láminas foliares en expansión, y verificar si se asocia con la manifestación de tipburn, y si la enfermedad se disminuye en incidencia al modificar la intensidad de producción de EROs por inhibidores/quelantes, o incrementa con promotores de EROs.

Determinar si existe daño oxidativo en relación al tipburn y si existe relación con la actividad de enzimas antioxidantes en márgenes de hojas en variedades tolerantes y susceptibles en tipburn.

Verificar la asociación entre la expresión de tipburn y la acumulación de Na+ y K⁺ en láminas foliares.

Capítulo 2: Relación entre el crecimiento y la manifestación del tipburn

2.1. Introducción

El tipburn ha sido referenciado en la bibliografía como una enfermedad que se expresa en hojas jóvenes en activo crecimiento y expansión en las cuales el Ca²⁺ demandado para el crecimiento resulta insuficiente (Barta y Tibbitts, 2000). Yanagi et al. (1983) afirmaron que no se originó tipburn cuando las tasas de expansión foliar invernales fueron bajas inclusive con una deficiencia de Ca²⁺ en el sustrato. El tipburn también es promovido por la salinidad en el sustrato (Sonneveld y Mook, 1983; De Pascale y Barbieri, 1995; Saure, 1998) que provoca una reducción del crecimiento, especialmente de la expansión foliar (Bernstein et al., 1993). Algunos trabajos relacionan un menor crecimiento vegetativo debido a la salinidad con la aparición de tipburn (Choi y Lee, 2001; Tzortzakis, 2009; Tzortzakis, 2010; Al-Maskri et al., 2010), pero, por otro lado, Tesi et al. (2003) observaron el efecto contrario, tipburn en los controles y ausencia en los tratamientos salinos con un menor crecimiento vegetativo. Esta es la primer controversia que se abordará en el presente capítulo: determinar si el tipburn se asocia necesariamente con regiones foliares con una alta tasa de crecimiento.

Según el tipo de sales y el efecto que tienen en el suelo, se pueden clasificar a los suelos en cuatro categorías: 1- el suelo salino donde el limite inferior de salinidad en éste es establecido convencionalmente en una CE del extracto de saturación de 4 dS · m⁻¹ (a 25 °C), 2- el suelo sódico que presenta un bajo contenido de sales, y contiene una cantidad de sodio intercambiable suficiente como para afectar adversamente a la producción de cultivos y a la estructura del suelo. Actualmente el parámetro utilizado es la RAS del extracto de saturación del suelo que debe ser mayor a 13, 3- el suelo alcalino que generalmente es nombrado como suelo sódico, pero debe tenerse en cuenta que aunque todos los suelos alcalinos son sódicos, no todos los sódicos son alcalinos. El criterio para definir un suelo alcalino es que posea un valor de pH muy elevado, mayor a 8,5, y por último 4- el suelo salino - sódico, esta categoría no es usada actualmente pero se refiere a un suelo donde el PSI es mayor a 15, y la CE > a 4 dS · m⁻¹ (a 25 °C), el pH del suelo saturado es usualmente 8,5 o menor (Lavado y Taboada, 2009). 

El efecto de la salinidad en las plantas usualmente se relaciona con reducciones en el rendimiento que dependen de las condiciones climáticas, edáficas y de las prácticas culturales (Mass, 1986). El estrés alcalino ocurre cuando el pH en el medio supera al neutro (pH 7), y es originado en general por la presencia de aniones CO₃²⁻ y HCO₃⁻, el estrés alcalino, también origina una reducción en el rendimiento (Yang et al., 2008a).

El tipburn se vincula a la salinidad fundamentalmente por el efecto osmótico en la solución del suelo, ya que genera una disminución del potencial hídrico del suelo condición en la que normalmente se observa una menor captación de Ca²⁺ por parte de las raíces (Sonneveld y Mook, 1983; De Pascale y Barbieri, 1995; Choi y Lee, 2001; Filgueiras et al., 2002; Cemek et al., 2011); también se referencia al tipburn con un menor contenido de Ca²⁺ en el suelo por lo que la utilización de menores concentraciones de Ca²⁺ en el sustrato influenciará en la expresión de los síntomas de tipburn.

La lechuga podría ser afectada de diferentes maneras por el estrés salino y alcalino, como ha sido observado en S. glauca que presenta tolerancia a la salinidad y no a la alcalinidad (Yang et al., 2008b). Ambas condiciones podrían afectar diferencialmente la manifestación de síntomas en diversos genotipos de lechuga, este aspecto no ha sido evaluado anteriormente.

En el presente capítulo se describen los resultados de la generación del tipburn bajo condiciones controladas, se caracteriza la susceptibilidad de los diversos genotipos evaluados, definiendo como tolerante al genotipo que no expresa síntomas en condición predisponente. Se evalúa también la relación entre el crecimiento y la manifestación de tipburn en condiciones de salinidad. Los resultados corresponden a las hipótesis 1, 2 de esta tesis y que se reiteran a continuación:

Condiciones de salinidad y alcalinidad incrementarán la incidencia del tipburn, y en lechuga la tolerancia a la salinidad medida como respuesta relativa de crecimiento, está positivamente correlacionada con la tolerancia al tipburn.

El tipburn se manifiesta en hojas en activo crecimiento, por ende, la modificación de las tasas de crecimiento modificarán la expresión del tipburn.

2.2. Materiales y Métodos

2.2.1. Material vegetal y tratamientos

Se realizaron 8 ensayos en cámara de crecimiento evaluándose plantas de las variedades Prima (Pr), Sunstar (Su), Pontina (Po) y Divina (Di) (lechugas mantecosas), cultivadas en hidroponía. Los genotipos utilizados fueron seleccionados en base a su tolerancia a tipburn. Pontina es considerada resistente al tipburn (semillero Clause), Sunstar es considerada moderadamente resistente (semillero Nickerson-Zwaan), Prima y Divina fueron consideradas como susceptibles (semillero Garde, Giusti y Chuchuy S.A.).

Las siembras se realizaron en bandejas de germinación (speedling) según normas ISTA (ISTA, 1996) a 20 ºC y con sustrato de 50 % tierra fértil y 50 % vermiculita. El período de siembra-transplante en todos los ensayos fue alrededor de 25 días.

Para el transplante se retiraron los plantines de las bandejas de germinación, se lavaron las raíces con agua destilada, colocándose en bandejas de germinación con el fondo perforado, sujetándolos al nivel del cuello con una banda de espuma de poliuretano. En cada bandeja se colocaron 8 plantas de lechuga. Dicha estructura fue instalada sobre un recipiente de 60 • 20,5 • 16 cm, desinfectado previamente con hipoclorito al 10 % (por única vez con esta concentración en bandejas nuevas) y pintado externamente de color negro, para evitar la incidencia de la luz en el sistema radicular y la proliferación de algas y microorganismos. Tales recipientes contenían 7 litros de solución nutritiva Hoagland (Fernández y Johnston, 1986), aireada por aireadores de pecera.

Todos los ensayos se realizaron con temperaturas y fotoperíodo en ascenso, condiciones que favorecen la predisposición al tipburn (Barta y Tibbitts, 2000; Cox et al., 1976). El fotoperíodo fue de 12 h en la etapa siembra-transplante y de 16 h en la etapa transplante-cosecha, la iluminación fue provista por lámparas incandescentes y de alta intensidad de descarga (HID). La densidad de flujo fotónico permaneció constante durante todo el ensayo en 350 μmol m⁻² s⁻¹, y estuvo limitada por las características de la cámara. Las temperaturas durante el primer período siembra-transplante hasta el comienzo de los tratamientos estuvieron en el rango de las temperaturas óptimas de crecimiento en lechuga y el fotoperíodo fue el correspondiente a la transición primavero-estival característica de Santa Rosa, La Pampa. En base a estas consideraciones las temperaturas y el fotoperíodo en todos los experimentos fueron:

20 ºC constantes y 12 h de luz en el período siembra-transplante, de 25 días.

24 ºC con 14 h de luz y 20 ºC en oscuridad a partir del transplante.

27 ºC con 16 h de luz y 24 ºC con 8 h de oscuridad a partir del inicio de los tratamientos en el séptimo día a partir del transplante.

36 ºC con 16 h de luz y 27 ºC en oscuridad, a los 20 días a partir del transplante.

En la cámara de crecimiento se registraron diariamente las temperaturas y humedades actuales, máximas y mínimas, con termómetro de mercurio y termohigrómetro digital. Con tales registros se calculó la sumatoria de ºC día (GD), en base a las temperaturas máximas y mínimas diarias, según la fórmula (1).

GD = Σ((Tmáx-Tb)+(Tmín-Tb))/2) (1)

Donde (Tmáx) es la temperatura máxima y (Tmín) es la temperatura mínima registrada. Se utilizó una temperatura base (Tb) de 6 ºC si bien para lechuga crespa la Tb es 3 ºC (Dapoigny et al., 1997) para la variedad mantecosa hay estudios que utilizan Tb mayores (Brunini et al., 1976).

Los experimentos 1 y 2 (ver tabla 1) fueron llevados a cabo con la solución Hoagland 100 %, en los siguientes experimentos se utilizó Hoagland al 50 %. Los ensayos, además, se efectuaron suministrando Ca²⁺ en concentración normal para esta solución (2,5 mM) o en concentración reducida (0,5 mM) ya que el tipburn se asocia a restricciones en el suministro de Ca²⁺ (Barta y Tibbitts, 1991; Barta y Tibbitts, 2000). Se cambió la solución nutritiva semanalmente y se desinfectaron las superficies de las bandejas contenedoras sumergiéndolas en agua con hipoclorito al 20 % para evitar y eliminar la proliferación de patógenos y algas; posteriormente las bandejas fueron lavadas con agua destilada. El día anterior y posterior a la renovación de la solución nutritiva, se procedió a registrar la conductividad eléctrica (CE) con un conductímetro Altronix CTX-1, y el pH y temperatura de la solución con un peachímetro Hanna HI 8424.

Según el experimento y la finalidad, se agregaron a la solución nutritiva sales de NaCl, NaHCO₃, o una combinación de ambas, los controles fueron sin agregados (tabla 1). Las sales fueron suministradas gradualmente (pulsos salinos) a la solución nutritiva a partir del séptimo día del transplante y culminando el tercer pulso salino al día 14. Los pulsos salinos fueron suministrados de la siguiente manera:

1º pulso salino (día 7, después del transplante): 4 mM NaHCO₃ ó 10 mM NaCl, ó 4 mM NaHCO₃ + 10 mM NaCl.

2º pulso salino (día 10, después del transplante): 8 mM NaHCO₃ ó 25 mM NaCl, ó 8 mM NaHCO₃ + 25 mM NaCl.

3º y último pulso salino (día 14, después del transplante): 10 mM NaHCO₃, ó 50 NaCl, ó 10 mM de NaHCO₃ + 40 mM de NaCl.

Tabla 1: Variedades de lechuga evaluadas y tratamientos, en los sucesivos ensayos.

Ensayo

Variedad

Tratamiento

Control

Control

NaCl 50 mM

NaCl 50 mM

NaCl 40 mM + NaHCO3 10 mM

NaHCO3 10 mM

NaHCO₃ 10 mM

Ca2+ 2,5 mM

Ca2+ 0,5 mM

Ca²⁺ 2,5 mM

Ca2+ 0,5 mM

Ca2+ 2,5 mM

Ca²⁺ 2,5 mM

Ca2+ 0,5 mM

1

Sunstar

×

×

×

×

2

Sunstar
Pontina

×

×

×

×

3

Sunstar
Pontina

×

×

×

×

×

4

Prima
Divina

×

×

×

×

×

×

5

Sunstar
Divina

×

×

×

×

×

×

6

Sunstar
Pontina

×

×

×

×

7

Sunstar
Pontina

×

×

8

Sunstar
Pontina

×

×

El control hace referencia a la solución nutritiva sin agregado de sales.

Las concentraciones de NaCl y NaHCO3 fueron seleccionadas a partir de los análisis del agua de riego en muestras extraídas de diferentes explotaciones hortícolas de la provincia de La Pampa (tabla 2); las concentraciones de NaCl y NaHCO₃ que se observan en la tabla 2 originan en poco tiempo que el extracto de saturación del suelo alcance el tenor salino (o mayor) al evaluado en los diferentes experimentos (Reinaudi et al., 2000). No hay hasta el momento trabajos que vinculen al tipburn con la presencia de NaHCO₃, por lo que los experimentos se llevaron a cabo con una concentración de 10 mM cercana a la utilizada por Bie et al. (2004) que estudiaron el efecto del NaHCO₃ en el crecimiento en lechuga.

Diariamente se verificaron posibles síntomas asociados a los tratamientos, tales como: clorosis, necrosis, toxicidad y principalmente desarrollo de tipburn. En los ensayos 1 y 2 se determinó diariamente la longitud de todas las hojas, midiendo en la cara adaxial la distancia desde la base de la nervadura hasta el extremo distal de la lámina; en los subsiguientes experimentos se realizaron las mencionadas mediciones en 5 plantas por tratamiento. Con tales datos se calcularon los índices de plastocrono (PI) y de plastocrono de hoja (LPI, ver más adelante).

Tabla 2: Característica química del agua de riego en 13 explotaciones hortícolas, obtenidas en diferentes departamentos de la Provincia de La Pampa; CE: conductividad eléctrica, RAS: relación de adsorción de sodio y TSD: total de sales disueltas.

Muestra

CE

(ds/m)

pH

RAS

TSD

mg.L⁻¹

Na⁺

meq.dm⁻³

K⁺

meq.dm⁻³

Ca²⁺

meq.dm⁻³

Mg²⁺

meq.dm⁻³

Cl⁻

meq.dm⁻³

SO₄²⁻

meq.dm⁻³

CO₃⁻

meq.dm⁻³

HCO₃⁻

meq.dm⁻³

1

1,36

6,21

557

20,13

0,13

34,7

2,23

5,1

1,1

0

5,2

2

3,3

9

36,8

948

30,46

0,5

0,49

0,89

7

6,43

8,59

12,02

3

0,86

7,55

11

640

7,17

1,12

1,1

0,59

1,49

2

0

6,39

4

1,88

8,16

19,7

1338

26,73

2

1,04

2,68

7,87

7,37

0

7,53

5

3,73

7,94

21,4

2676

34,14

0,48

1,85

3,15

19,17

12,06

0

8,19

6

1,24

8,29

13,6

765

10,37

0,13

0,54

0,62

1,2

0,74

3,02

7,37

7

0,5

8,02

3,41

292

3,49

0,1

0,88

1,22

0,33

0,58

0

4,13

8

0,61

7,29

3,69

325

3,91

0,13

1,2

1,08

0,81

0,5

0

5,05

9

1,24

7,26

13,5

832

10,3

0,11

0,52

0,64

0,92

0,74

0

11

10

1,06

7,42

6,46

640

7,6

0,15

0,95

1,67

2,25

1,13

0

6,93

11

0,43

6,8

3,68

270

3,2

0,08

0,7

0,83

0,48

0,25

0

4,13

12

1,41

7,54

6,05

600

10,1

0,8

2,465

3,1

1,1

0,4

0

1,72

13

1,54

6,9

9,34

980

11,85

0,66

1,58

1,57

0,98

0,7

0

7,2

La cosecha de todas las plantas (96) fue realizada en promedio a los 60 días (+/- 7 días) después de la emergencia según el experimento. Se contabilizaron número de hojas vivas, senescentes y con síntomas de tipburn. Se fotografiaron los individuos que presentaban cambios con respecto a los controles (clorosis, diferencia en tamaño, muerte de tejidos, deformación de brotes, hojas y tipburn). En ese momento también se determinaron peso fresco y seco de raíz y parte aérea, longitudes finales de parte aérea y raíz, largo y ancho de cada hoja, y área foliar total en planta con un medidor de área foliar LI-COR modelo LI-3000A. En base a esos datos se calcularon las relaciones peso seco/peso fresco y raíz/parte aérea.

2.2.2. Índices de plastocrono de planta (PI) y de plastocrono de hoja (LPI)

Con los datos de crecimiento foliar se determinó el índice de plastocrono de planta (PI) y el índice de plastocrono de hojas (LPI) (Erickson y Michelini, 1957). El plastocrono es un índice que representa la edad de la planta en unidades de plastocronos y es utilizado para poder realizar estudios de crecimiento y desarrollo independientemente de la edad cronológica. En la práctica el PI está definido por la longitud entre dos hojas sucesivas medido a partir de una longitud tomada como referencia y de manera arbitraria. Este cálculo requiere de las mediciones de dos hojas sucesivas: una con la longitud inmediatamente superior a la longitud de referencia y otra medición de la hoja inmediatamente inferior a la longitud de referencia (fórmula 2).

P.I.=

n + Log Ln - log λ / log Ln - log Ln+1

(2)

- n = Número de la hoja inmediatamente superior a la long. de referencia.

- Ln = Longitud de la hoja inmediatamente superior a la long. de referencia.

-Longitud de referencia fijada en nuestro estudio en 0,7 mm.

- Ln +1 = Longitud de la hoja siguiente a n que es igual, o es cercana a la longitud de .

El LPI (fórmula 3) representa el estado de desarrollo de la hoja y/o la edad de la misma en unidades de plastocronos, siendo conjuntamente con el PI independientes del tiempo. El uso de estos índices permitió comparar, en el mismo estadío de desarrollo, las hojas de plantas provenientes de diversos tratamientos.

L.P.I. = P.I. – i (3)

i. Número de hoja en cuestión

2.2.3. Caracterización de síntomas de tipburn

Durante el transcurso de los ensayos, se procedió al registro de la primera hoja con tipburn. Se determinó el número de días transcurridos desde emergencia hasta la ocurrencia de la primera manifestación, y durante la cosecha se determinó el porcentaje de plantas afectadas.

Para la determinación de la severidad del tipburn se procedió a tomar fotografías digitales, definiendo a los síntomas como severos (hojas malformadas, muerte de meristema, o más del 80 % de las hojas afectadas), medios (algunas hojas viejas o pequeños puntos necróticos en el meristema, con pequeñas manchas en hojas ennegrecidas y deformadas) y leves (apenas los primordios centrales con pequeñas manchas, pudiendo haber recuperación de las hojas sin consecuencias económicas). Con estos datos se calculó la incidencia de tipburn por medio de la fórmula de Frantz (Frantz et al., 2004, fórmula 4).

IT =

[(S • 5) + (M • 3) + (L • 1)] • 100 / P • 5

(4)

IT = Índice de tipburn.

S = Número de plantas con quemado de bordes severo.

M = Número de plantas con incidencia media en el quemado de hojas.

L = Número de plantas con quemado de bordes leves.

P = Número de plantas totales.

2.2.4. Descripción de la cinética de crecimiento de hojas, caracterización de la distribución de tasas de expansión

Con el fin de determinar la dinámica del crecimiento en los diversos tratamientos, desde el día 15 posterior a la siembra se procedió a determinar diariamente la emergencia, longitud y aparición de hojas de 96 individuos, tomando como hoja emergida a toda aquella que superaba los 5 mm de longitud. A partir del transplante y en cada tratamiento, continuaron los registros anteriores en forma periódica hasta el día de la cosecha, en 5 individuos elegidos al azar.

La longitud de hojas, se determinó midiendo en la cara adaxial la distancia desde la base de la nervadura hasta el extremo distal de la lámina. Con esos datos se procedió a calcular la tasa de elongación foliar relativa (TEFR) mediante la fórmula (5).

TEFR =

Log A – Log B / T2 – T₁

(5)

TEFR = Tasa de elongación foliar relativa.

A = Longitud foliar en el tiempo T₂.

B = Longitud foliar en el tiempo T₁.

T1 = Tiempo inicial de medición.

T₂ = Tiempo final de medición.

Los registros se obtuvieron hasta la hoja número 18 en las 5 plantas seleccionadas.

-Caracterización de la distribución de las tasas de expansión foliar:

Para evaluar si existe relación entre la manifestación de tipburn y las zonas en activo crecimiento, la dinámica de expansión foliar se analizó en hoja 14, ya que esta hoja usualmente manifestaba síntomas de tipburn y presentó un tamaño que facilitó realizar las mediciones. Para ello se marcaron 11 puntos con un marcador de ojos marca Avon Color Luxury, sobre la cara adaxial de las hojas que tenían aproximadamente 3,5 cm de largo. Diariamente se tomaron imágenes digitales en 4 hojas de cada tratamiento, durante 5 días. Un disco de papel de 5,5 mm de diámetro colocado sobre la superficie foliar, sirvió de referencia para el análisis de las imágenes. Con los puntos señalados se trazaron 19 rectas formando triángulos. Las rectas fueron medidas con un programa de análisis de imágenes de dominio público (ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij); las unidades tomadas en píxeles fueron convertidas a milímetros gracias al disco de referencia. La superficie de los triángulos se determinó por medio de las fórmulas de Heron (fórmulas 6 y 7), a fin de determinar la dinámica de crecimiento de cada uno de los mismos. Posteriormente se graficaron las tasas de expansión de cada triángulo, calculadas mediante la fórmula 5, utilizando superficie en vez de longitud.

S = √p (p - a) (p - b) (p - c) (6)

p =

a + b + c / 2

(7)

S = Superficie del triángulo definido por los lados a, b y c.

P = Semiperímetro del triángulo definido por los lados a, b y c.

2.2.5. Análisis estadístico

Los resultados fueron evaluados por ANOVA, sometidas a pruebas de diferencias de medias (p ≤ 0,05), utilizando el programa InfoStat (InfoStat/Profesional ver. 2008p, Grupo InfoStat, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina).

2.3. Resultados

2.3.1. Caracterización de las soluciones de cultivo

La evolución de la CE y pH de la solución de cultivo se ve en las figuras 1, A y B, donde se pueden apreciar los valores promedios de pH y CE en función de la sumatoria en ºC∙día⁻¹ en los dos primeros experimentos. La utilización de distintas concentraciones de Ca²⁺ (2,5 y 0,5 mM) no afectó los valores de CE y pH.

El NaCl fue la sal de mayor efecto electrolítico en comparación con el NaHCO₃, ya que a un mismo nivel isoequivalente de Na⁺ entre el NaCl y la combinación con NaHCO₃ las CE fueron mayores cuando el catión se encontraba asociado con Cl⁻. Este efecto era esperado en función de la fuerza relativa de los aniones (Cl⁻ > HCO₃⁻) (Pitzer, 1977). Sin embargo se midió la CE porque en una solución compleja la disociación de sales también depende de otros factores como la temperatura (Hopkins, 1995). A su vez el elevado pH y el HCO₃- originan interacciones con otros iones y posibles precipitaciones de sales insolubles (Richards, 1977) que pueden originar una disminución de la CE. La concentración de la solución Hoagland 100 % utilizada durante el primer y segundo experimento incrementó entre 2,5 y 3 la conductividad eléctrica en comparación con Hoagland 50 % (figura 1 del apéndice).

Figura 1: A. Conductividad eléctrica y B. pH en la solución nutritiva Hoagland al 100 %, y con el agregado de NaHCO₃ 10 mM, NaHCO3 10 mM + NaCl y 40 mM, y NaCl 50 mM en función de la acumulación de grados día.

A.

B.

Los resultados corresponden al primer y segundo ensayo, donde se utilizaron las variedades Sunstar y Pontina (n=4), las barras indican ± error estándar. Las mediciones se tomaron a las 16 h del cambio de la solución nutritiva.

No existieron diferencias entre el pH del tratamiento control con respecto al tratamiento de NaCl, mientras que el agregado del 10 mM de NaHCO₃ incrementó el pH en 2,5 puntos. Las diferentes concentraciones de la solución Hoagland (100 y 50 %) no afectaron el pH registrado en un mismo tratamiento (figura 1 del apéndice).

2.3.2. Generación e incidencia del tipburn

Se registraron síntomas de tipburn en los ocho ensayos realizados, y solamente en los tratamientos salinos y alcalinos. Las variedades que los expresaron fueron Sunstar, Divina y Prima, mientras que Pontina no los presentó en ninguno de los experimentos realizados (tabla 3).

Tabla 3: Variedades de lechuga y expresión de tipburn en los diferentes tratamientos.

Ensayo

Variedad

Tratamiento

Control

Control

NaCl 50 mM

NaCl 50 mM

NaCl 40 mM + NaHCO₃ 10 mM

NaHCO₃ 10 mM

NaHCO₃ 10 mM

Ca2+ 2,5 mM

Ca2+ 0,5 mM

Ca²⁺ 2,5 mM

Ca2+ 0,5 mM

Ca2+ 2,5 mM

Ca²⁺ 2,5 mM

Ca2+ 0,5 mM

1

Sunstar

o

×

×

×

2

Sunstar

o

×

×

×

Pontina

o

o

o

o

3

Sunstar

o

×

×

×

o

Pontina

o

o

o

o

o

4

Prima

o

o

×

×

o

×

Divina

o

o

×

×

o

×

5

Sunstar

o

o

×

×

×

o

Divina

o

o

×

×

o

×

6

Sunstar

o

o

×

×

Pontina

o

o

o

o

7

Sunstar

o

×

Pontina

o

o

8

Sunstar

o

×

Pontina

o

o

(x) manifestación de tipburn y (o) ausencia de tipburn. El control hace referencia a la solución nutritiva sin agregado de NaCl ó NaHCO₃.

Las primeras hojas en expresar síntomas variaron entre la 14 y 19, según la variedad y el tratamiento (tabla 4). Se utilizó la mediana porque es un estadístico descriptivo de tendencia central que describe adecuadamente una medida de posición de eventos discretos y cuantitativos, como lo es la manifestación de síntomas de tipburn en una hoja determinada. Por otro lado a diferencia de la media aritmética, los valores calculados a partir de la mediana presentaron valores enteros (unidad discreta), por lo que se optó por expresar los valores es base a valores enteros y no a partir de unidades continuas (expresión decimal de la hoja). Una de las metas del trabajo fue la obtención del síntoma en el menor tiempo posible, sin embargo, en las condiciones experimentales presentes no resultó posible la obtención de tipburn antes de los 47 días a partir de la emergencia.

En los 8 ensayos con NaCl, los primeros síntomas ocurrieron cercanos a los 930 ºC∙d⁻¹. El primer ensayo presentó los síntomas de manera más temprana a los 720 ºC∙d⁻¹ y en el ensayo 3 se obtuvieron más tardíamente a los 1080 ºC∙d⁻¹.

Tabla 4: Primera hoja con tipburn en lechuga cultivada en condiciones de salinidad y alcalinidad, con dos niveles de Ca2+ en la solución nutritiva.

Tratamiento

Ensayo

1

2

3

5

NaCl 50 mM Ca²⁺ 2,5 mM

16

17

19

17

NaCl 50 mM Ca²⁺ 0,5 mM

17

17

NaCl + NaHCO₃ 40 mM + 10 mM Ca²⁺ 2,5 mM

14

17

NaHCO₃ 10 mM Ca²⁺ 2,5 mM

15

15

17

14

NaHCO3 10 mM Ca2+ 0,5 mM

16

16

Resultados de la variedad Sunstar (en los ensayos 1 y 2 n=12, en 3 y 5 n=8). Los datos expresan la mediana de la distribución.

En las primeras hojas en expresar síntomas, se observaron pequeñas puntuaciones necróticas que se expandieron posteriormente (figuras 2 y 3). Por lo general, eran las hojas más jóvenes; que presentaron una longitud menor a 3 cm y la necrosis se expandió en el margen superior, afectando el tercio superior de la hoja. Cuando las hojas eran mayores a 3 cm, los síntomas se expresaron inicialmente en el margen inferior.

Figura 2: Síntomas de tipburn en sucesivas hojas de plantas de la variedad Sunstar cultivadas con 50 mM de NaCl.

Síntomas registrados en el momento de la cosecha a los 1029,5 ºC∙d⁻¹.

Los tratamientos que contenían NaHCO₃, en general expresaron los síntomas en hojas más jóvenes que los tratamientos que contenían NaCl (tabla 4) y tuvieron una mortandad de plantas del 3 %. En el primer ensayo, los síntomas de tipburn en el tratamiento con NaCl + NaHCO₃ ocurrieron cercanos a los 825,5 ºC∙d⁻¹, en ese momento la primera hoja promedio con síntomas fue la número 14; con NaHCO₃ ocurrieron cercanos a los 780 ºC∙d⁻¹ y la primera hoja con síntomas fue la número 15; en el tratamiento con NaCl a los 800 ºC∙d⁻¹ y la primera hoja en expresarlo fue la número 16. Las hojas afectadas, en todos los casos presentaron una menor longitud con respecto al control.

Figura 3: Síntomas de tipburn en sucesivas hojas de plantas de la variedad Sunstar cultivadas con 10 mM de NaHCO₃.

Síntomas registrados en el momento de la cosecha a los 1029,5 ºC∙d⁻¹.

Los tratamientos a los que se les agregó NaCl + NaHCO₃ presentaron síntomas de toxicidad en forma conjunta con los de tipburn, clorosis y deformaciones foliares (figura 4), existió muerte de ápice y una mortandad de plantas alrededor de un 5 %, motivos por los cuales resultó difícil la evaluación posterior de los síntomas de tipburn.

Figura 4: Síntomas de toxicidad en la variedad Sunstar, originados por el tratamiento con 40 mM de NaCl + 10 mM de NaHCO₃.

Síntomas registrados en el momento de la cosecha a los 1029,5 ºC∙d⁻¹; las hojas y el ápice pertenecen a diferentes plantas.

El cálculo de la incidencia del tipburn, permitió evaluar el efecto de los tratamientos salinos, y a partir de este índice se identificó la tolerancia a la enfermedad (tabla 5). La variedad Po no expresó síntomas en ninguno de los tratamientos. En las demás variedades, la incidencia varió según el tratamiento. En el cuarto ensayo, la variedad Pr presentó menor incidencia que Di; por tal motivo se decidió evaluar en el quinto ensayo Di con Su, para determinar cuál fue el material con mayor susceptibilidad. La variedad Su presentó mayor incidencia que Di en todos los tratamientos donde se manifestó la enfermedad (tabla 5) y en esta variedad, la mayor incidencia se observó en los tratamientos que contenían NaCl, y se incrementó con un bajo suministro de Ca2+ (0,5 mM).

Tabla 5: Incidencia del tipburn en plantas de las variedades Divina, Pontina, Prima y Sunstar (en los ensayos 1 y 2 n=12, en los restantes ensayos n=8), en los diversos tratamientos salinos y con distinta disponibilidad de Ca²⁺.

Tratamiento

Concentración de Ca²⁺

Incidencia del tipburn (%)

Sunstar

Pontina

Divina

Prima

NaHCO₃ 10 mM

2,5 mM

16

0

0

0

NaHCO₃ 10 mM

0,5 mM

0

0

34,28

10

NaHCO₃ 40 mM + NaCl 10 mM

2,5 mM

10,52

0

sin/det.

sin/det.

NaCl 50 mM

2,5 mM

45,04

0

18,75

5

NaCl 50 mM

0,5 mM

77,5

0

45

3,5

En Divina y Prima no se evaluó la combinación de ambas sales.

Tabla 6: Porcentaje de plantas afectadas por tipburn (%), en plantas de las variedades Divina, Pontina, Prima y Sunstar (en los ensayos 1 y 2 n=12, en los restantes ensayos n=8), en los diversos tratamientos salinos y con distinta disponibilidad de Ca²⁺.

Tratamiento

Concentración de Ca²⁺

Plantas afectadas por tipburn (%)

Sunstar

Pontina

Divina

Prima

NaHCO₃ 10 mM

2,5 mM

45

0

0

0

NaHCO₃ 10 mM

0,5 mM

0

0

25

50

NaHCO₃ 40 mM + NaCl 10 mM

2,5 mM

35,78

0

sin/det.

sin/det.

NaCl 50 mM

2,5 mM

68,91

0

56,25

25

NaCl 50 mM

0,5 mM

93,5

0

94

12,5

En Divina y Prima no se evaluó la combinación de ambas sales.

En Su, no se expresaron los síntomas en el tratamiento de NaHCO3 con 0,5 mM de Ca²⁺, diferenciándose del tratamiento con NaCl que incrementó la incidencia y el porcentaje de plantas afectadas (tablas 5 y 6).

En resumen, Su y Po fueron las variedades que mayor contraste presentaron, ya que Su tuvo la mayor incidencia y % de plantas afectadas y en Po no se registraron síntomas, en Su la incidencia y el porcentaje de plantas afectadas en condiciones de salinidad se incrementaron con una menor disponibilidad de Ca²⁺. Las condiciones de repetitividad del sistema experimental para la obtención de tipburn fue variable en el tratamiento alcalino en contraste con el tratamiento salino. En base a este resultado, a la mortandad de plantas y a las dificultades en la evaluación de síntomas en alcalinidad, los ensayos subsiguientes se realizaron únicamente con las variedades Su y Po, y el tratamiento con NaCl.

2.3.3. Relación entre aparición de síntomas y crecimiento

Al tipburn se lo relaciona con condiciones que favorecen el crecimiento (Barta y Tibbitts, 2000) tales como: temperaturas cálidas, alta luminosidad y humedad ambiental, buena disponibilidad hídrica, alto contenido de nutrientes, y exceso de nitrógeno en forma amoniacal en el sustrato. Sin embargo, la salinidad y alcalinidad que normalmente disminuyen el crecimiento, predisponen al tipburn (tablas 3, 5 y 6). Por tal motivo en la siguiente sección se evaluó la relación entre el crecimiento y la manifestación de tipburn.

2.3.4. Efecto de la salinidad y alcalinidad del sustrato sobre el crecimiento vegetativo en plantas de lechuga

En la tabla 7, se observan las diferentes variables de crecimiento determinadas en la cosecha de los primeros 6 experimentos para las variedades Po (que no manifestó síntomas de tipburn en condiciones de salinidad y alcalinidad) y Su que presento una alta incidencia, según los tratamientos indicados en la tabla 5.

Tabla 7: Efecto de la salinidad y alcalinidad del sustrato y de la distinta disponibilidad de Ca²⁺ (2,5 y 0,5 mM) en la solución nutritiva sobre el crecimiento vegetativo, en las variedades Pontina y Sunstar.

Tratamiento

Variedad

Conc. de Ca²⁺ (mM)

Altura de la parte aérea (cm)

Longitud radicular (cm)

Peso fresco de la parte aérea (g)

Peso seco de la parte aérea (g)

Peso seco en raíz (g)

Área foliar (cm²)

Relación raíz/parte aérea

Control

Pontina

2,5

20,02 a

30,72 ab

28,96 a

1,16 a

0,88 a

891,90 a

0,60 abc

0,5

18,16 b

31,75 a

25,34 ab

1,06 ab

0,82 ab

809,30 abc

0,83 a

NaHCO₃

10 mM

Pontina

2,5

14,54 def

20,09 f

13,66 def

0,84 abcde

0,58 cd

606,48 cdef

0,51 bcd

0,5

11,71 hi

23,48 def

13,27 def

0,74 bcde

0,53 d

560,75 def

0,61 abc

NaCl 40 mM

+ NaHCO₃

10 mM

Pontina

2,5

12,35 ghi

20,09 f

9,23 ef

0,63 cde

0,54 d

530,65 def

0,49 bcd

NaCl 50 mM

Pontina

2,5

15,84 cd

29,26 abc

15,74 cde

0,99 abc

0,74 abc

727,97 abcd

0,75 ab

0,5

16,10 cd

28,16 abc

17,89 cd

0,8 abcde

0,66 bcd

685,86 bcde

0,86 a

Control

Sunstar

2,5

17,64 bc

28,81 abc

24,62 ab

1,11 a

0,58 cd

850,57 ab

0,46 cd

0,5

16,06 cd

27,77 abcd

21,79 bc

1,05 ab

0,29 e

889,07 ab

0,30 d

NaHCO₃ 10 mM

Sunstar

2,5

13,61 efg

21,34 ef

14,09 de

0,95 abcd

0,34 e

478,59 fg

0,35 cd

0,5

13,00 fgh

21,64 ef

11,04 ef

0,61 de

0,29 e

441,33 fg

0,50 bcd

NaCl 40 mM + NaHCO₃ 10 mM

Sunstar

2,5

10,55 i

19,49 f

7,22 f

0,58 e

0,24 e

279,30 g

0,41 cd

NaCl 50 mM

Sunstar

2,5

14,43 def

24,84 cde

14,99 de

0,98 abc

0,32 e

512,52 ef

0,33 cd

0,5

14,76 de

26,67 bcd

15,04 de

0,83 abcde

0,29 e

530,05 def

0,36 cd

Los resultados expresan la media de todos datos obtenidos durante los ensayos, n=8 - 30, según el tratamiento y variable de respuesta. Letras distintas indican diferencias significativas entre tratamientos y por variable (Test de Tukey p ≤ 0,05).

Los controles de ambas variedades, cultivados con 2,5 mM de Ca²⁺ tuvieron similar crecimiento vegetativo en todas las variables analizadas. En el control de Po una menor disponibilidad de Ca²⁺ en la solución nutritiva disminuyó significativamente la altura de la parte aérea, mientras que en Su se observó una disminución significativa en el peso seco radicular, y esta disminución fue similar a las que ocurrieron en los tratamientos con NaCl.

En condiciones de salinidad y alcalinidad, se observó una disminución con respecto a los controles en todas las variables de crecimiento vegetativo evaluadas. En general el NaHCO₃ ocasionó una disminución más importante que el NaCl, tuvieron mayor efecto negativo sobre el crecimiento en los tratamientos que contenían la combinación de ambas sales. En cada variedad la baja disponibilidad de Ca²⁺ disminuyó el peso seco radicular y la relación raíz/parte aérea.

En los tratamientos salinos y alcalinos se observó una disminución del peso fresco de la parte aérea alrededor de 30 a 70 %, y la combinación de ambas sales fue la que mayor disminución originó, este efecto se observó en mayor medida en la variedad susceptible Su. En la variedad Po los tratamientos con NaCl, NaHCO3 y la combinación de ambas originaron una menor reducción en el área foliar.

Como se observó en la tabla 7, en los distintos tratamientos no existieron diferencias entre variedades en el peso seco de la parte aérea, en cambio al analizar la relación raíz/parte aérea en el tratamiento con NaCl se observó una mayor relación en la variedad Po con respecto a Su. En las variedades Di y Pr las tendencias generales en las variables de crecimiento analizadas fueron similares a las respuestas que se observaron en Su y Po.

En resumen en condiciones de alcalinidad se observó un mayor efecto en la disminución del crecimiento vegetativo que en salinidad; y la variedad Po, tolerante al tipburn, se comportó como tolerante a la alcalinidad y salinidad en comparación con Su. Entre ambas condiciones puede decirse que tuvo mayor tolerancia a la salinidad.

2.3.5. Efecto de la salinidad y alcalinidad sobre el crecimiento foliar

Se analizaron las tasas de elongación foliar para determinar si existió un vínculo entre un activo crecimiento y la aparición de los síntomas (tabla 8). En general la aparición de los síntomas de tipburn (en Su) bajo condiciones salinas y alcalinas ocurrió en hojas que eran más cortas que los controles. Una vez culminado el último pulso salino las tasas de elongación en los diferentes tratamientos comenzaron a diferenciarse con respecto al control. En cada hoja, las TEFR tendieron a disminuir en función del tiempo. Sin embargo, en general, no hubo diferencias estadísticas en las TEFR de los sucesivos períodos, debido a la variabilidad entre las muestras. Tal variabilidad no permitió distinguir si la expresión de síntomas se verificó en hojas cuyas TEFR hubieran sido diferencialmente afectadas por los tratamientos. Dado que los tratamientos afectaron el desarrollo de las plantas, el índice de plastocrono (PI) permitió comparar hojas de plantas en un mismo estado de desarrollo.

Tabla 8: Tasas de elongación foliar relativa (cm • cm⁻¹ • d⁻¹) (TEFR), en las hojas 10, 14, 15 y 16 en función de la acumulación de grados día, en plantas controles y tratadas con NaCl 50 mM, NaHCO₃ 10 mM + NaCl 40 mM y NaHCO₃ 10 mM, en la variedad Sunstar.

Hoja

ºC·día⁻¹

Control

NaCl 50 mM

NaCl 40 mM + NaHCO₃ 10 mM

NaHCO₃ 10 mM

10

596

0,0628 abcd

0,0931 bcd

0,0465 abc

0,0435 abc

629

0,0296 abc

0,0347 abc

0,0245 a

0,0164 ab

663

0,0152 a

0,0235 a

0,0098 a

0,0164 a

700

0,0242 ab

0,0117 a

0,0157 abc

0,0292 a

800

0,0038 a

0,0121 a

0,0052 a

0,0068 a

14

629

0,1344 abcd

0,1818 d

0,1109 abcd

0,1896 d

663

0,1124 abcd

0,1487 abcd

0,1664 cd

0,1091 abcd

700

0,0735 abcd

0,1166 abc

0,1326 abcd

0,0537 abc

800

0,0352 ab

0,0406 a

0,0475 abc

0,0085 a

825,5

0,0093 a

0,0106 a

0,0091 a

0,0081 a

15

629

0,0901 ab

0,1679 ab

0,0485 ab

0,0915 ab

663

0,1755 ab

0,1505 ab

0,0343 a

0,1787 ab

700

0,0812 ab

0,1682 ab

0,0825 ab

0,2228 b

800

0,0631 ab

0,0415 a

0,0869 ab

0,1543 a

16

629

0,2193 ab

s/d

s/d

0,1102 ab

663

0,2228 a

0,1455 ab

0,1171 ab

0,2023 ab

700

0,0507 ab

0,1549 ab

0,0741 ab

0,0949 ab

800

0,0344 b

0,0514 ab

0,0676 ab

0,0411 ab

En las hojas 14, 15 y 16. Los valores en negrita y sombreados corresponden a la aparición de los primeros síntomas. Letras distintas indican diferencias significativas en cada hoja y en el tratamiento (Test de Tukey p≤ 0,05).>

2.3.6. PI y aparición de síntomas

Los valores de PI (índice que describe el estado de desarrollo), fueron graficados en función de la acumulación de grados día, a fin de caracterizar el efecto de los tratamientos salinos sobre el desarrollo de las plantas en el momento de la aparición de los síntomas (figura 5). Los datos de PI obtenidos en el primer experimento, fueron ajustados a curvas de regresión lineal, que se muestran a continuación:

Y = -13,12 + 0,75X (8)   Y = -11,07 + 0,66X (9)

Y = -8,65 + 0,55X (10)   Y = -10,31 + 0,64X (11)

Ecuaciones de predicción del PI: (8) en el Control, (9) NaHCO₃, (10) NaHCO3 + NaCl y (11) NaCl. La prueba de bondad de ajuste altamente significativa (p≤ 0,05).

El tratamiento que tuvo mayor pendiente fue el control y el de menor pendiente fue el que combinó ambas sales (Ecuación 10).

Las curvas de desarrollo, comenzaron a apartarse desde el comienzo de los tratamientos (figura 5). Los tratamientos con NaCl y NaHCO₃ presentaron síntomas en similares estados de desarrollo (en los 5 primeros experimentos cercanos a un PI entre 21,5-23,5), mientras que en la combinación de ambas sales los síntomas ocurrieron en un estado de desarrollo menor (PI cercano a 19). El control presentaba mayor estado de desarrollo (PI), que los tratamientos en los cuales ocurrieron los síntomas.

Se observó que la combinación de ambas sales fue el tratamiento que presentó menor PI al momento de manifestar síntomas, sin embargo fue el tratamiento en el cuál los síntomas ocurrieron más tardíamente (figura 5). Es posible que los efectos de toxicidad manifestados con la combinación de ambas sales, hayan producido los síntomas en un estadío de desarrollo menor.

Figura 5: Efecto de los tratamientos salinos sobre el índice de plastocrono (PI), en función de la acumulación de grados día transcurso del experimento expresado en la variedad Sunstar (curvas de ajuste obtenidas del primer ensayo).

Los círculos indican el momento de la aparición de los primeros síntomas, y la flecha el inicio de los tratamientos; pruebas de bondad de ajuste altamente significativas (p≤ 0,05).

El PI permitió describir los días con las TEFR para un mismo estado de desarrollo, en los distintos tratamientos (tabla 9). Se observó que las tasas de elongación foliar en las hojas que manifestaron tipburn fueron similares o menores a los controles para un mismo estadío de desarrollo (PI). Es decir que el tipburn no puede asociarse unívocamente a alteraciones de las TEFR, ocurriendo tanto en hojas que crecían normalmente como en aquellas cuyas TEFR se vieron disminuidas por los tratamientos.

Por lo que se observa en la tabla 9, una vez más se comprobó que no existe relación entre un crecimiento activo y el tipburn en condiciones de alcalinidad y salinidad.

Tabla 9: Tasas de elongación foliar relativa (cm • cm⁻¹ • d⁻¹) (TEFR) comparada en un mismo estado de desarrollo (PI).

Hoja

Tratamiento

PI

Grados día, que corresponden a un similar PI entre tratamientos

Tasa relativa de elongación foliar (cm ∙ cm⁻¹∙ d⁻¹)

14

Control

19,02

646

0,094 bc

NaCl

19,02

720

0,129 c

NaCl+NaHCO₃

19,02

825,5

0,009 a

NaHCO₃

19,02

700

0,054 ab

15

Control

21,86

720

0,116 a

NaCl

21,86

825,5

0,112 a

NaCl+NaHCO₃

21,86

902

sin datos

NaHCO₃

21,86

780

0,154 a

16

Control

21,53

700

0,051 a

NaCl

21,53

800

0,051 a

NaCl+NaHCO₃

21,53

902

sin datos

NaHCO₃

21,53

760

0,069 a

17

Control

23

740

0,147 b

NaCl

23

825,5

0,069 a

NaCl+NaHCO₃

23

953

sin datos

NaHCO₃

23

800

0,089 a

Resultados corresponden al primer ensayo en la variedad Sunstar donde los primeros síntomas se expresaron en: hoja 14, 15 y 16 según los tratamientos que se indican. También se presentan los valores en la hoja 17 obtenidos durante el tercer ensayo a un PI de 23, ésta fue la primera hoja promedio en manifestar tipburn en el tratamiento salino con NaCl en los subsiguientes experimentos. Los valores en negrita y sombreado corresponden a la aparición de los primeros síntomas. Letras distintas indican diferencias significativas, medias evaluadas con test de Tukey (p≤ 0,05).

El índice calculado para describir el estado de desarrollo en la hoja (LPI), no resulto de utilidad ya que el tipburn ocurrió en distintos estados de desarrollo en las hojas donde se manifestaron los síntomas (distintas longitudes foliares). Por tal motivo, bajo condiciones salinas fue más adecuado interpretar los síntomas en función del PI que del LPI.

2.3.7. Efecto de los tratamientos salinos y alcalinos sobre la distribución de la expansión en láminas foliares

Los resultados anteriores mostraron que la aparición de síntomas de tipburn no tenía relación con las TEFR. Tal parámetro integra la totalidad del crecimiento de la hoja. En esta sección se relacionó la dinámica del crecimiento en diferentes zonas de la hoja con la manifestación de los síntomas de tipburn. Los triángulos fueron definidos de manera tal que posibilitaran realizar comparaciones según las zonas en las cuales eventualmente ocurren síntomas (márgenes) con las zonas en las que no es habitual el tipburn (centro), y además comparaciones entre las regiones distales y proximales de la hoja que difieren en la manifestación de síntomas.

Durante el transcurso del segundo ensayo, se determinó la expansión de superficies individuales en la hoja 14, durante los cinco días previos a la manifestación de síntomas de tipburn según datos del primer ensayo, es decir en el período comprendido entre los 780-902 ºC∙d⁻¹. Con los puntos definidos sobre la hoja, se trazaron triángulos a los que se asignaron letras según la posición (figura 6).

Figura 6: Triángulos definidos en la hoja 14 de las variedades Pontina y Sunstar, en los que se efectuaron el análisis de las tasas de expansión relativas (cm2 • cm-2 • d⁻¹), MD: margen distal, MP: margen proximal, CD: región central de la mitad distal y CP: región central de la mitad proximal.

Los síntomas ocurrieron por lo general en las superficies definidas por los triángulos “MP” (figura 6). Estas crecieron a una tasa elevada en los controles de ambas variedades, y continuaron creciendo a la misma manera en la variedad Po con NaCl y NaHCO₃ (tabla 10), pero la tasa de crecimiento disminuyó significativamente en el tratamiento combinado con ambas sales. En Su todos los tratamientos salinos y alcalinos provocaron una disminución significativa del crecimiento en todos los sectores de la hoja (tabla 10). La combinación de ambas sales fue el tratamiento que causó la mayor disminución en la tasa de expansión. Las tasas de expansión en las zonas centrales de la hoja (definidas por los triángulos CD y CP, figura 6), también fueron afectadas con los tratamientos salinos y alcalinos en la variedad Su y sólo disminuyeron en Po con la combinación de ambas sales.

En los tratamientos salinos no se observó un activo crecimiento en las zonas donde usualmente se manifiestan los síntomas, inclusive en la base de la hoja y en la variedad Su que presentó una alta incidencia de tipburn en el tratamiento con NaCl la tasa de expansión fue de un 59 % con respecto al control.

El efecto en la disminución de la tasa de expansión observado en la variedad Su en los tratamientos, comprobó que el tipburn no está vinculado con una activa expansión en los márgenes de las hojas en condiciones salinas y alcalinas.

Por lo tanto, estos resultados muestran que el tipburn se manifestó en zonas de la hoja cuyo crecimiento había sido significativamente disminuido por los tratamientos, previamente a la aparición de los síntomas. Es interesante destacar que tal disminución no se manifestó en todos los casos en la variedad Pontina, tolerante al tipburn. En resumen, los resultados de este apartado y el anterior pusieron de manifiesto la ausencia de correlación entre crecimiento normal y expresión de síntomas, por lo contrario, los mismos aparecieron en hojas y zonas de la hoja con crecimiento deprimido.

Tabla 10: Tasa de expansión foliar relativa (TER, cm2 • cm-2 • d⁻¹) en diferentes zonas de la hoja 14 en las variedades Pontina y Sunstar. Plantas cultivadas bajo condiciones control (Co), en solución salina (S, 50 mM de NaCl), solución alcalina (A, 10 mM NaHCO₃) y alcalina más salina (A + S, 10 mM NaHCO3 + 40 mM de NaCl). Las zonas se indican como M: margen de la hoja, C: central, P: mitad proximal, D: mitad distal.

Tratamiento

Zona

Posición

Pontina
TER

% Co

Sunstar
TER

% Co

Co

M

P

0,368

ghi

0,430

i

D

0,321

fg

0,318

fg

C

P

0,389

hi

0,410

i

D

0,342

ghi

0,290

defg

S

M

P

0,308

efg

84

0,253

bcdef

59

D

0,234

bcd

73

0,216

abc

68

C

P

0,300

defg

77

0,248

bcde

60

D

0,270

def

69

0,203

ab

70

A

M

P

0,403

hi

110

0,363

ghi

84

D

0,310

fg

97

0,200

ab

63

C

P

0,411

i

106

0,257

cdef

63

D

0,338

gh

87

0,209

ab

72

A+S

M

P

0,320

fg

87

0,300

defg

70

D

0,202

ab

63

0,175

a

55

C

P

0,332

g

85

0,267

gh

65

D

0,248

bcde

64

0,173

def

60

Letras distintas indican diferencias significativas (LCD test, p≤ 0,05). Los triángulos semejantes y simétricos correspondientes al sector izquierdo y derecho fueron promediados al no presentar diferencias estadísticas entre sí. Para facilitar la interpretación de la tabla, las diferencias significativas de los controles están marcadas en negrita y cursiva.

2.4. Discusión

2.4.1. Sistemas experimentales para el estudio de las causas fisiológicas asociadas a la manifestación del tipburn

La mayoría de los trabajos de investigación relacionados con el tipburn, se han realizado en el campo o en condiciones controladas, y sólo se han centrado en evaluar la relación entre la incidencia del tipburn con el incremento de la conductividad eléctrica (CE), y el contenido de Ca2+ y su desbalance respecto de otros iones de la solución nutritiva; también el contenido del Ca²⁺ y otros elementos en hojas (Barta y Tibbitts, 2000; Filgueiras et al., 2002; Beninni et al., 2003; Santos et al., 2005; Grangeiro et al., 2006).

Existen pocas investigaciones en lechuga que analicen de manera detallada el vínculo entre el tipburn y la salinidad. Hay trabajos en los que se relacionó la aparición de síntomas en cultivos realizados en el campo a partir de riego con el agregado de NaCl (Sonneveld y Mook, 1983; Sonneveld y Van Beusekom, 1974; De Pascale y Barbieri, 1995). Recientemente se realizaron algunos estudios fisiológicos en invernaderos con condiciones controladas que vincularon al tipburn con los efectos del NaCl, con concentraciones que variaron entre 10 y 100 mM de NaCl (Choi y Lee, 2001; Tzortzakis, 2008; Tzortzakis, 2009; Al-Maskri et al., 2010), Tesi et al. (2003) investigaron en sistemas flotantes (NFT) y describieron síntomas en los controles y no en los tratamientos salinos con 10, 20 y 30 mM de NaCl. Estas concentraciones de NaCl y las registradas de análisis de aguas utilizadas para riego en La Pampa, sirvieron de referencia para investigar los efectos específicos ligados al tipburn en lechuga en variedades comúnmente utilizadas en la producción hortícola local.

Si bien existen referencias en la obtención de tipburn a los 13 días posteriores de la emergencia (Saure, 1998), y en condiciones que favorecen el crecimiento (tasa de aparición de hojas de 1,5 h∙d⁻¹ aproximadamente), en los ensayos de esta tesis la tasa de aparición de hojas al día 15 posterior a emergencia fue cercana a 1 h∙d⁻¹, menor que la citada en la bibliografía (Saure, 1998), esta razón podría haber sido la causa por la cual en los experimentos realizados en el presente trabajo no se expresaron los síntomas antes de los 47 días a partir de la emergencia. Nuestros resultados concuerdan con investigaciones que describieron la aparición de tipburn en condiciones de salinidad en estadíos de crecimiento más avanzados, observados en cultivo a campo (Sonneveld y Mook, 1983; De Pascale y Barbieri, 1995) y en condiciones controladas (Choi y Lee, 2001; Tzortzakis, 2009; Al-Maskri, 2010).

Temperaturas y fotoperíodos crecientes favorecieron la incidencia de tipburn (Koontz y Prince, 1986; Goto y Takakura, 2003), condiciones que también fueron efectivas para la inducción del tipburn en los ensayos de esta tesis. Se relacionó al tipburn en repollo chino (Pressman et al., 1993) y en lechuga (Tibbitts y Rao, 1968; Gaudreau et al., 1994), con la alta radiación que ocurre en verano. En Santa Rosa La Pampa durante la primavera tardía y el verano los síntomas son más intensos que en el período otoño-invernal, y suelen ocurrir antes en suelos salinizados de invernaderos en comparación a los cultivos realizados a campo, la radiación en invernaderos suele ser aproximadamente la mitad o menor que en los cultivos realizados a campo (datos no publicados). En los experimentos realizados se obtuvieron síntomas de tipburn con baja radiación (densidad de flujo fotónico de 350 μmol m⁻² s⁻¹), estos resultados sugieren que en condiciones de salinidad no es necesario que existan altas irradiancias para la manifestación de síntomas.

Tradicionalmente se asocia al tipburn con una deficiencia de Ca²⁺. Koyama et al. (2011) evaluaron “in vitro” 19 variedades de lechuga cultivadas en agar con 1 mM de EGTA (quelante de Ca²⁺) para evaluar resistencia al tipburn, las variedades que se consideraron resistentes y no expresaron tipburn en los tratamientos con EGTA fueron luego estudiadas en hidroponía, y se observó una correlación con los experimentos realizados “in vitro”. En los experimentos de esta tesis la incidencia de tipburn se incrementó con menor disponibilidad de Ca²⁺ (0,5 mM) en la solución nutritiva, confirmando que la restricción del suministro del Ca²⁺ participa en la manifestación de los síntomas bajo condiciones de salinidad. Sin embargo, en algunos trabajos la suplementación de Ca²⁺ no ocasionó reducción de los síntomas (Pereira et al., 2005). Hartz et al. (2007) estudiaron una muestra de 15 variedades comerciales de lechuga romana con una alta incidencia de tipburn cultivadas a campo y no encontraron una relación entre el contenido de Ca²⁺ en hojas y el contenido de Ca²⁺ en el suelo; estos resultados indicaron que la deficiencia de calcio por sí sola no explicaría la aparición de síntomas de tipburn.

No existen referencias o estudios sobre incidencia de tipburn en condiciones de alcalinidad. En el presente trabajo se describe por primera vez la incidencia de la enfermedad en condiciones de alcalinidad, y que existe tolerancia al tipburn en condiciones de alcalinidad, también se observó una relación entre la tolerancia a la salinidad con el tipburn. La variedad de verano Sunstar considerada por los semilleros, como de buena productividad en invernaderos y moderadamente tolerante al tipburn, fue la que presentó mayor susceptibilidad en condiciones tanto de salinidad como de alcalinidad; variedades de lechuga consideradas como tolerantes también se comportaron como susceptibles cuando fueron cultivadas en condiciones distintas a las evaluadas por los semilleros (Holtschulze, 2005). Por los resultados expuestos, y a causa de que el tipburn puede originarse por diversos factores ambientales, es necesario evaluarlo en las condiciones ambientales prevalentes en la zona de cultivo. Sin embargo, fue variable la reproducibilidad en los ensayos con alcalinidad, lo que sumado a la mortandad de plantas y a la aparición de síntomas de toxicidad, condujo a la decisión de abordar la verificación de las hipótesis del capítulo siguiente, únicamente con el tratamiento salino.

Como se describió en los antecedentes el tipburn fue estudiado en numerables condiciones desde que se realizaron las primeras investigaciones hace más de cien años (Thompson, 1926; Wisseimeier y Zühlke, 2002), e incluso en los antecedentes se encuentran muchas contradicciones, y se generalizan las medidas de prevención (Saure, 1998). A causa de que diferentes tipos de estrés pueden desencadenar el tipburn es relevante describir detalladamente las condiciones de cultivo de la planta al momento de la aparición de los síntomas como se realizó en el presente trabajo, para poder dilucidar el origen de la enfermedad y las posibles maneras de prevenirlo. A medida que se realicen nuevas investigaciones más profundas el tipburn va a dejar de ser un “misterio” como mencionaron Saure (1998) y Wisseimeier y Zühlke (2002).

2.4.2. Efecto de la salinidad y alcalinidad sobre el crecimiento vegetativo

Para la realización de los experimentos el nivel de salinidad seleccionado (50 mM NaCl) fue acorde a los niveles que usualmente se pueden encontrar en el extracto de saturación del suelo en explotaciones hortícolas de la región en donde se realizó el presente estudio (Reinaudi et al., 2000), este nivel salino no ocasiona un estrés excesivo ya que fue inferior a los contenidos de NaCl utilizados en lechuga por otros autores (Lazof y Cheeseman, 1988; Lazof y Bernstein, 1999; Al-Maskri et al., 2010; Bartha et al., 2010; Cemek et al., 2011), otro motivo en la elección fue permitir el desarrollo del cultivo en forma conjunta con la manifestación de síntomas. El nivel de alcalinidad utilizado respondió a los criterios mencionados y según los niveles alcalinos evaluados por Bie et al. (2004).

Como se observa en las figuras 2 y 3, en general las primeras necrosis en las hojas pequeñas se expresaron en el ápice mientras que en las hojas que poseían más de 3 cm presentaron síntomas en la base, a medida que continúa la manifestación de síntomas, las necrosis pueden continuar en todo el contorno de la hoja pero surge el interrogante de por qué este patrón en la manifestación del tipburn. Lazof y Bernstein (1999) observaron en lechuga tratada con 80 mM de NaCl que el transporte y el contenido de Ca²⁺ es afectado de distinta manera según el número de hoja y según el estado de desarrollo. Choi y Lee (2001) analizaron el contenido y el patrón de distribución del isótopo radiactivo ⁴⁵Ca²⁺ mediante foto-luminiscencia y descubrieron que en las hojas pequeñas el contenido y la distribución del ⁴⁵Ca2+ en el ápice y en los márgenes superiores fue menor que en el resto de la hoja, en las hojas de mayor tamaño el contenido y la distribución del ⁴⁵Ca2+ comenzó a ser limitante en el margen inferior, en los tratamientos en los cuáles se agregó NaCl hasta obtener las CE de 4,5 y 9 dS m⁻¹ en la solución de cultivo el contenido y la distribución del ⁴⁵Ca²⁺ disminuyó significativamente en todas las partes de la hoja, fundamentalmente en las zonas mencionadas. Por otra parte se observó en los cultivares de tomate Calypso y Spectra que el BER que se desarrolló en los ápices en condiciones de salinidad se relacionó con un menor desarrollo y número de vasos cribosos lignificados del xilema (Ho et al., 1993; Ho y White, 2005), por lo que el desarrollo del sistema vascular en los diferentes estadíos de crecimiento en las hojas, pueden estar relacionados con la zona de manifestación inicial del tipburn en lechuga, y, en el ápice de las hojas pequeñas podría haber menor desarrollo del xilema ocasionando tipburn inicialmente en esa zona. Por otro lado en las hojas de mayor tamaño no solamente sería crítico el contenido y distribución del Ca²⁺ en la base, si no que las tasas de expansión son mayores que en otros sectores, por lo que la demanda de Ca²⁺ en esa zona sería crítica y podría ser una de las causales de que inicialmente ocurran los síntomas.

Muchas referencias indican que el tipburn ocurre en condiciones de activo crecimiento (Collier y Tibbitts, 1982; Collier y Huntington, 1983; Wissemeier, 1996; Kleeman, 2000). Tesi et al., (2003) evaluaron el efecto del NaCl (10, 20 y 30 mM) y describieron un mayor crecimiento y la aparición de tipburn en el control sin salinidad. Sin embargo, el síntoma también es característico de plantas que crecen bajo condiciones de estrés, donde el crecimiento es restringido. En forma simultánea al desarrollo de la presente tesis, otros autores encontraron una disminución en las variables de crecimiento y tipburn en los tratamientos salinos (Tzortzakis, 2009; Tzortzakis, 2010; Al-Maskri et al., 2010). Choi y Lee (2001) evaluaron en la variedad Omega el efecto del NaCl e informaron, a medida que incrementó la salinidad, una menor concentración de ⁴⁵Ca²⁺ y una disminución del crecimiento y peso fresco foliar en las zonas donde se manifestó el tipburn. Por lo tanto, tal como se observó en esta tesis, es posible detectar ocurrencia de tipburn en condiciones de disminución del crecimiento.

Se observó en lechuga en condiciones de salinidad una disminución de la fotosíntesis y un efecto directo sobre las estructuras fotosintéticas (Carter y Cheeseman, 1993; Choi y Lee, 2001; Bartha et al., 2010), que en forma conjunta con el crecimiento celular son algunos de los procesos primarios que son afectados por el estrés salino (Chaves et al., 2009) y alcalino (Yang et al., 2008b). La disminución del peso seco en los tratamientos salinos con respecto al control podría haber estado vinculada a una menor tasa fotosintética.

El estrés originado por sales alcalinas (NaHCO₃ y Na₂CO₃) es más intenso para los vegetales que las sales neutras (NaCl y Na₂SO₄) (Shi y Yin, 1993) y condiciones alcalinas en el sustrato afectan negativamente el crecimiento de lechuga, tal como se vio en este trabajo. Anteriormente, Bie et al. (2004) describieron una disminución en el área foliar, longitud y ancho foliar y peso seco en plantas de lechuga cultivadas con 7,5 mM de NaHCO₃.

Por otra parte, los tratamientos con bicarbonato en nuestros experimentos originaron muerte de plantas y clorosis no relacionadas con el tipburn, similar sintomatología fue observada por Bie et al. (2004) en lechuga tratada con 5 y 7,5 mM de NaHCO₃. El NaHCO₃ puede originar toxicidad a causa del anión HCO₃⁻, al ser transportado vía xilemática ocasiona un incremento del pH en el apoplasto en las células de la hoja (Mengel y Geurtzen, 1986) y de la raíz, por afectar la actividad de la H⁺-ATPasa localizada en la membrana (Dell’Orto et al., 2000; M’Sehli et al., 2008), el incremento del pH puede causar la precipitación de los iones que forman sales insolubles a elevados pH, y la inhibición de la actividad enzimática como la Fe3+ reductasa ubicada en el plasmalema y que participa en la reducción del Fe³⁺ que luego es transferido a través de la membrana plasmática (Coulombe et al., 1984; Mengel y Geurtzen, 1986). Las clorosis que se observaron en los tratamientos con NaHCO₃ en todas las variedades de lechuga evaluadas podrían ser clorosis férricas, como se observó en plantas de soja tratadas con bicarbonato donde el incremento del pH en el medio de cultivo afectó la disponibilidad y entrada del Fe a las raíces (Coulombe et al., 1984).

El efecto en la disminución del desarrollo y del crecimiento foliar y vegetativo fue mayor en los tratamientos con la combinación de NaCl y NaHCO₃ en la solución nutritiva. El agua de riego utilizada en La Pampa y en la zona del “gran La Plata” puede contener NaCl, NaHCO₃, o ambas, y no existen trabajos previos que describan y comparen en lechuga los efectos de la combinación de ambas sales. Es posible que en lechuga exista tolerancia diferencial a la salinidad y alcalinidad, como fue observado en S. glauca que es tolerante a salinidad pero no a alcalinidad (Yang et al., 2008b). Sin embargo, dado que tales tratamientos generaron síntomas de toxicidad en forma conjunta con los de tipburn, clorosis y deformaciones foliares, muerte de ápice y una mortandad de plantas, se decidió eliminar a partir del tercer ensayo los tratamientos que contenían la combinación de ambas sales.

La relación raíz/parte aérea podría tener un vínculo con la aparición de síntomas, en las plantas que no pertenecen al grupo de las halófitas el crecimiento radicular es menos afectado que el crecimiento en las hojas (Munns y Termaat, 1986) y origina una mayor relación raíz/parte aérea que en plantas no salinizadas; sin embargo, en lechuga las condiciones de salinidad y alcalinidad originaron una menor relación raíz/parte aérea que en plantas no salinizadas, a causa de que el sistema radicular también disminuyó el crecimiento.

Según Brumm (1992) en plantas de lechuga que tienen un crecimiento acelerado y que manifestaron tipburn, el balance entre la parte aérea y las raíces se traduce en una menor relación raíz/tallo, que originó una disminución en la provisión de agua y del Ca²⁺ por unidad de parte aérea, incrementando la susceptibilidad al tipburn. La variedad Sunstar presentó una menor relación raíz/parte aérea en comparación con Pontina en los tratamientos con NaCl y NaHCO₃, el menor desarrollo radicular podría haber originado una disminución en la captación de Ca²⁺ y un incremento en la consiguiente manifestación de la enfermedad.

Los efectos de la alcalinidad y salinidad descriptos anteriormente no se habían comparado anteriormente en variedades tolerantes y susceptibles al tipburn. La variedad tolerante al tipburn Pontina fue la que presentó mayor tolerancia al estrés salino y en menor medida al alcalino. La tolerancia al estrés salino y alcalino en relación con el crecimiento vegetativo podría estar indirectamente vinculada con la tolerancia al tipburn.

2.4.3. Relación entre aparición de síntomas y crecimiento foliar

Es un efecto común en lechuga que la salinidad (Martínez et al., 1996) y la alta conductividad eléctrica (Huett, 1994) originen una disminución en el tamaño y peso fresco de la hoja, por lo tanto, y como era de esperar, las hojas afectadas por tipburn, en todos los tratamientos presentaron un menor tamaño y peso fresco con respecto al control. No existen trabajos que analicen detalladamente qué ocurre con las tasas de expansión en las zonas donde usualmente se manifiestan síntomas de tipburn en condiciones de salinidad y alcalinidad como en el presente trabajo de tesis. El PI fue útil para describir en los distintos tratamientos, las TEFR para un mismo estado de desarrollo. Contrariamente a los antecedentes que vinculan el tipburn con un activo crecimiento foliar (Collier y Tibbitts, 1982; Collier y Huntington, 1983; Wissemeier, 1996; Kleeman, 2000) las TEFR en el tratamiento salino, fueron menores o no presentaron diferencias significativas con respecto al control cuando se las comparó en un mismo estado de desarrollo (PI). El control de Sunstar no presentó síntomas de tipburn en un PI donde el tratamiento salino si expresó síntomas. Sin embargo, en coincidencia con Lazof et al. (1991) la longitud foliar final en el tratamiento salino fue menor que en el control.

Las condiciones de salinidad y alcalinidad originaron una reducción de gran magnitud en las tasas relativas de expansión foliar en las zonas de la hoja evaluada que usualmente son afectadas por tipburn, siendo éste un aspecto relevante nunca antes evaluado. Pontina, la variedad tolerante al tipburn, presentó mayor expansión foliar en condiciones de salinidad y alcalinidad que Sunstar (variedad susceptible), y mayores tasas de expansión en las zonas donde Sunstar posteriormente manifestaría síntomas. Un menor efecto de los tratamientos salinos y alcalinos sobre las tasas de expansión foliar en Pontina originó una mayor área foliar final en comparación con la variedad Sunstar (tabla 7). El análisis de la expansión foliar permitió hacer un aporte relevante para caracterizar al tipburn en condiciones de salinidad, ya que gran parte de los autores en la bibliografía afirma que el tipburn ocurre en aquellas hojas o partes de las hojas que se expandieron más rápidamente (Maynard y Barker, 1972; Collier y Huntington, 1983); estas afirmaciones bibliográficas son contrastantes con los resultados obtenidos en esta tesis. En condiciones que originaron elevadas tasas de crecimiento foliar, el Ca²⁺ disponible en el sustrato podría ser inferior al incremento de la demanda en los tejidos y no ser suficiente para mantener el crecimiento y posteriormente conducir a la muerte celular (Collier y Tibbitts, 1982; White y Broadley, 2003). Por otra parte, en condiciones de salinidad el Na⁺ que ingresó a los tejidos afectó negativamente el crecimiento y la expansión celular (Munns, 2002) y su toxicidad puede provocar también la muerte celular (Munns y Tester, 2008). Simultáneamente la salinidad resulta en una menor disponibilidad de Ca²⁺ en los tejidos, lo cual podría contribuir a los efectos mencionados (Choi y Lee, 2001; Filgueiras et al., 2002; Cemek et al., 2011).

En hojas de lechuga la etapa exponencial de crecimiento foliar tiene una duración de apenas unos días (Lazof et al., 1998). Esta etapa, en la que ocurren los eventos de división celular, es afectada sensiblemente por la salinidad y por ende incide mayormente sobre las hojas más jóvenes, comprendidas entre la 14 hasta la 19. Estas fueron las primeras hojas promedio en manifestar tipburn en los ensayos del presente trabajo. En este sentido, se puede afirmar que el tipburn que se manifiesta en condiciones de salinidad se encuentra vinculado a las hojas en activo crecimiento, las más afectadas también por el tratamiento salino. Por otro lado se observaron distintos efectos cuando el tipburn ocurre en condiciones que favorecen el crecimiento, Collier y Huntington (1983) indicaron que el tipburn no sólo depende del contenido de Ca²⁺ en las hojas, sino también de la oferta relativa de Ca²⁺ en relación con la tasa de crecimiento de las hojas; Holschure (2005) observó en la variedad Herman que era susceptible al tipburn un mayor crecimiento y número de hojas por planta, que la variedad tolerante Nadine; es evidente que en condiciones salinas el tipburn no depende de la oferta relativa de Ca²⁺ en relación con la tasa de crecimiento de las hojas, pero si se encuentra vinculado con la menor disponibilidad del Ca²⁺.

En este trabajo se comprobó que el tipburn puede ocurrir en condiciones de crecimiento atenuado y aún en ellas es promovido por la baja disponibilidad de calcio en el sustrato.

De los resultados de este capítulo surge el próximo interrogante: si las condiciones en la que ocurrió el tipburn en un ambiente de salinidad y/o alcalinidad no favorecieron el crecimiento en comparación con el control, y un menor contenido de calcio sólo originaron tipburn en interacción con los tratamientos salinos ¿Cuál es el vínculo entre el calcio y la salinidad en el origen del tipburn?

Capítulo 3: La manifestación del tipburn en relación con el suministro local de Ca²⁺, y el nivel de EROs

3.1. Introducción

En condiciones de estrés salino se producen EROs, que pueden causar daño oxidativo (Munns y Tester, 2008). Se relacionó la podredumbre basal en pimiento, en condiciones de salinidad con la producción de EROs en hojas y zonas del fruto afectadas, debido a que la salinidad incrementó las EROs en el apoplasto de las células del pericarpio, a causa de un incremento en la actividad de la NADPH oxidasa (Aktas et al., 2005). En plantas de arveja, el NaCl originó estrés oxidativo inducido por el incremento de O₂.-/H₂O₂ en el apoplasto, y la posterior aparición de necrosis foliares; se observó una ausencia de síntomas en el cultivar tolerante a la salinidad (Hernández et al., 2001). Las necrosis del borde de las hojas, características del tipburn, podrían ser consecuencia de incrementos locales de EROs.

Existen otras evidencias que sugieren esta conexión. Por una parte, se ha observado en hojas de tomate una relación entre la deficiencia de Ca²⁺ y el estrés oxidativo (Schmitz-Eiberger et al., 2002); por lo que una menor disponibilidad de Ca²⁺ en la solución nutritiva o por secuestro/quelantes en hoja podría incrementar las EROs en hojas y también generar síntomas de tipburn. Por otra parte, en condiciones de salinidad se observó en lechuga un incremento de EROs que originaron daño oxidativo (Eraslan et al., 2007). Si las necrosis del tipburn, son consecuencia de incrementos locales en EROs, y si en la producción de éstas se encuentra involucrada la NADPH oxidasa de membrana la aplicación de inhibidores deberían disminuir o evitar los síntomas, como también la aplicación de antioxidantes.

En el capítulo 2 se caracterizó en Pontina una correlación entre la tolerancia a la salinidad y el tipburn, Lopez et al., (2011) describieron una mayor actividad de la enzima antioxidante CAT en variedades que presentaron tolerancia a la salinidad. Si el tipburn se relaciona con el estrés oxidativo originado por la salinidad la variedad tolerante Pontina podría suponer una mayor actividad de enzimas antioxidantes.

Por otro lado, se observó en el capítulo 2 que una menor disponibilidad de Ca²⁺ incrementó la incidencia del tipburn, y si la enfermedad en condiciones de salinidad también se encuentra relacionada con la concentración de Ca²⁺ en los márgenes, la manipulación de la concentración local de Ca²⁺ modificará la expresión del tipburn.

Como se desarrolló en el capítulo 2, el tipburn en condiciones de salinidad se relacionó con bordes de hojas que presentaron menor crecimiento y expansión que los controles, por lo que surge la hipótesis de que también estarían involucrados en la manifestación del tipburn los efectos específicos de la salinidad, en la cual la sal absorbida por la planta se concentra en las hojas, y la acumulación de NaCl puede ocasionar lesiones (Munns, 1993, 2002 y 2005; Bharta et al., 2010) y tipburn en lechuga. Se describió que la tolerancia a la salinidad puede ser dependiente de una baja concentración de Na⁺ en hojas y de una mayor relación K⁺/Na⁺ (Munns, 2002; Tester y Davenport, 2003). La tolerancia al tipburn, podría estar relacionada con una menor concentración de Na⁺ en los tejidos de la hoja y una mayor relación K⁺/Na⁺.

En el presente capítulo se describen los resultados en los cuales se verificó si la modificación de la concentración local de Ca²⁺, mediante disminución en el suministro y secuestro por quelantes, incide en la expresión de síntomas de tipburn; se determinó si la expresión de síntomas se vincula con la expresión de daño oxidativo y la presencia de EROs, y se caracterizó la relación entre la respuesta antioxidante; también se evaluó el contenido de iones en hojas en las variedades con diferencias en la manifestación de tipburn; resultados que corresponden a las hipótesis 3, 4 y 5 de esta tesis y que se reiteran a continuación:

El tipburn se asocia a alteraciones en la distribución/suministro de Ca²⁺ (y otros iones) en la hoja. Por lo tanto, la manipulación de la concentración local de Ca²⁺ mediante el suministro o el secuestro, disminuirá o incrementará respectivamente la expresión del tipburn.

La manifestación de tipburn se incrementará en función de la acumulación foliar de Na⁺.

La manifestación de tipburn resulta de la presencia de EROs en láminas foliares,

5.1. Apoplásticas, involucradas en el control del crecimiento celular e ingreso de Ca²⁺ (en células en crecimiento) o bien simplásticas o apoplásticas, que generan estrés oxidativo (en células expandidas y en crecimiento).

5.2. Variedades con diversa susceptibilidad a tipburn diferirán en el control enzimático del estrés oxidativo: habrá menor expresión de tipburn en variedades con mayor actividad antioxidante.

3.2. Materiales y Métodos

A partir del sexto experimento se evaluaron las variedades Sunstar y Pontina, escogidas por tener alta y baja incidencia de tipburn respectivamente, se cultivaron en las condiciones descriptas precedentemente en el capítulo 2 y con el agregado de 50 mM de NaCl en la solución nutritiva.

3.2.1. Modificación de la concentración local de Ca²⁺ y aplicación tópica de antioxidantes en los bordes de la hoja

La finalidad de los tratamientos fue determinar si los síntomas de tipburn se relacionaron con la modificación de la concentración local del Ca²⁺ y el desarrollo de estrés oxidativo.

Los tratamientos descriptos a continuación fueron aplicados de manera tópica, con un pincel, en los bordes de las hojas mencionadas, y todos fueron hechos tanto en plantas cultivadas en presencia de salinidad (50 mM NaCl) como en sus controles. Las soluciones aplicadas tópicamente (tabla 11) fueron: 50, 25 y 10 mM de ethylene glycol-bis (beta-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA), quelante específico para el secuestro de Ca²⁺ en células vegetales (Yun et al., 2007) (tabla 11); inhibidores del transporte de Ca²⁺ de la célula como verapamil (Rodríguez et al., 2007), LaCl₃ y aplicación del ionóforo (A.23187) + 1 mM de Ca2+ para facilitar la entrada de Ca²⁺. Por otra parte, para determinar si el tipburn está asociado al desarrollo de estrés oxidativo, éste se alteró mediante la aplicación tópica del antioxidante tiron (sodium 4,5-dihydroxybenzene-1,3-disulfonate), “scavenger” de EROs (Bustos et al., 2008) y de DPI (difeniliodonio), inhibidor de la NADPH oxidasa de membrana, sistema productor de EROs (Bolwell, 1992; Bernstein et al., 2010). Los tratamientos se realizaron en hoja 17 (la primera hoja promedio que manifestó síntomas de tipburn en ensayos previos) cuando poseía entre 6 y 10 cm de longitud, las aplicaciones tópicas fueron en los márgenes de la hoja (zona donde se manifiestan los síntomas). Los tratamientos y muestreos fueron evaluados en plantas a un mismo estado de desarrollo según el índice de plastocrono (PI) (Erickson y Michelini, 1957). Los tratamientos fueron realizados con un PI de 20, anterior a la aparición de síntomas, y la evaluación se efectuó con un PI aproximado de 23,5; estado donde se espera haya expresión de síntomas.

Se tomaron fotografías digitales en las que se evaluó cualitativamente la incidencia del tratamiento tópico sobre la manifestación del tipburn. La cuantificación de los efectos de los tratamientos sobre la manifestación de síntomas se realizó analizando la proporción de la superficie foliar necrosada por medio del programa de dominio público ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij).

Tabla 11: Soluciones tópicas y sus efectos, aplicadas en hoja 17 en las variedades Pontina y Sunstar.

Tratamiento tópico.

Efecto.

EGTA 50, 25 y 10 mM (pH 7,8).

Secuestro del Ca2+ apoplástico.

Verapamil 10 mM.

Bloqueante de canales Ca²⁺.

LaCl₃ 10 mM.

Bloqueante de canales Ca²⁺.

Ionóforo 5 µM + 1 mM.

de Ca²⁺.

Favorece el ingreso del Ca²⁺ a través de las membranas celulares.

Tiron 50 mM.

Antioxidante (scavenger de EROs).

DPI 50 µM.

Inhibidor de la NADPH oxidasa de membrana plasmática.

3.2.2. Determinación de la presencia de EROs

La distribución O₂.- en hojas de plantas control y salinizadas, se determinó mediante tinción con NBT (nitro blue tetrazolium). El NBT, al reaccionar con O₂.- produce formazán, un precipitado de color azul. Las hojas fueron sumergidas en una solución de NBT al 0,01 %, en un quitasato conectado a una bomba de vacío. Se realizaron 4 minutos de infiltración en vacío destapando cada 15 segundos el quitasato para romper el vacío y favorecer la infiltración del líquido en el interior de la hoja, posteriormente se procedió al blanqueamiento de las clorofilas colocando las hojas en etanol al 80 %, a 100 ºC hasta la eliminación completa de la coloración verde. Las hojas luego fueron escaneadas con scaner hpF4280. La imagen en color fue transformada a escala de grises, y posteriormente a imágenes en blanco negro; en las imágenes en color las zonas de mayor intensidad de color azul se correspondieron con las de color negro en las imágenes en escala de grises y estas zonas corresponden a la de mayor concentración de O₂.-.

3.2.3. Determinación de daño oxidativo por acumulación de malondialdehído (MDA)

Se determinó la concentración de malondialdehído, producto de la peroxidación de lípidos insaturados, por reacción con ácido tiobarbitúrico (TBA). La extracción se realizó según Dhindsa y Matowe (1981) en muestras de un peso aproximado de 200 mg de hojas. Las muestras se molieron en nitrógeno líquido y se les agregó 1 ml de ácido tricloroacético (TCA) al 3 %. El extracto homogéneo fue centrifugado a 14.000 rpm por 10 minutos. A 150 µl de sobrenadante se agregaron 150 µl de TCA (20 %) + TBA (0,5 %), las mezclas fueron incubadas 25 minutos a 95 ºC, luego fueron centrifugadas a 14.000 rpm y posteriormente enfriadas. La medición de la absorbancia (DO) del MDA de las reacciones resultantes fue determinada a partir de la diferencia de las lecturas entre 532 y 600 nm para corregir por la absorbancia de la feofitina (Hodges y Nozzolillo, 1996). La concentración de MDA se calculó usando el coeficiente de extinción de 155 mM -1 cm ⁻¹ (Heath y Parker, 1968) según la fórmula 12.

MDA (Mmol mg⁻¹) = ΔDO • Vext• D • 155 • Pf • 1000 (12)

MDA = malondialdehído.

ΔDO = diferencia de DO a 532 y 600 nm de la muestra.

Vext = volumen de extracción de la muestra.

D = factor de dilución.

155 mM -1 cm -1 = coeficiente de extinción según Heath y Parker (1968).

Pf = peso fresco de la muestra.

1000 = constante para conversión de unidades (ml/l).

Las unidades del MDA calculadas a partir de la fórmula 12 fueron posteriormente expresadas en (µmol g⁻¹).

3.2.4. Daño de las membranas celulares

El daño de las membranas celulares se determinó, en base a la metodología desarrollada por Sullivan (1972) (Test de Sullivan). El principio de la metodología es que a mayor daño de membranas (producto de una situación de estrés), ocurre una mayor liberación de electrolitos y se registra una mayor conductividad eléctrica (Blum y Ebercon, 1981) en el medio de incubación de las muestras. Se extrajeron de cada planta 7 discos de 13 mm, se enjuagaron tres veces con agua destilada, se colocaron en recipientes de vidrio con 20 cm³ de agua destilada y se mantuvieron en refrigerador a 7 ºC, durante 24 h. Al cabo de ese tiempo las muestras se retiraron del refrigerador, permanecieron a temperatura ambiente por una hora, y luego se les midió la conductividad eléctrica (conductímetro Altronix, modelo CTX-1).

Posteriormente los recipientes se taparon y fueron autoclavados por 15 min a 115 ºC. Una vez en equilibrio con la temperatura ambiente, se procedió a medir nuevamente la conductividad eléctrica. Se estimó el daño de membranas celulares (DMC) mediante la fórmula (13).

DMC = 100 - [(1 – (1-T1/T2) / (1-C1/C2)] • 100) (13)

T1 = representan la conductividad de las plantas en los tratamientos del ensayo antes del autoclavado.

T2 = conductividad de las plantas en los tratamientos después del autoclavado.

C1 = representa la conductividad de las plantas control del ensayo antes del autoclavado.

C2 = conductividad de las plantas control después del autoclavado.

Los resultados se analizaron mediante ANOVA y separación de medias por DMS (p≤ 0,05).

3.2.5. Medición de la actividad de las enzimas antioxidantes SOD, CAT y APX

La determinación de la actividad en las tres enzimas, se realizó en ápice y base de las hojas, dos regiones que difieren en la manifestación de síntomas de tipburn (en la base es donde se manifiestan inicialmente los síntomas) para determinar la asociación entre actividad antioxidante y expresión de tipburn.

Extracción para la determinación de las enzimas SOD y CAT:

La mezcla de extracción consistió en: 50 mM de buffer de KPO₄ a pH 7; + 1 mM de EDTA + 5 mM de NaCl + PVP. Para la extracción se molió la muestra (aproximadamente 50 mg) en mortero con aire líquido, con el agregado de 1 ml de mezcla de extracción. Posteriormente se centrifugo a 14.000 rpm durante 25 min a 4 ºC. El sobrenadante fue utilizado para la determinación de la actividad enzimática.

Extracción para la determinación de la enzima APX:

La mezcla de extracción consistió en: 50 mM de buffer de KPO₄ a pH 7,5; + 1 mM de EDTA + 5 mM de NaCl + 1 mM de ácido ascórbico + PVP. Para la extracción se molió la muestra en mortero (aproximadamente 50 mg) con aire líquido, con el agregado de 1 ml de mezcla de extracción. Posteriormente se procedió como en SOD y CAT.

a) Determinación de la actividad de la enzima superóxido dismutasa (SOD):

La actividad SOD se determinó según Beauchamp y Fridovich (1971); el fundamento de la técnica plantea que la luz UV influye sobre la riboflavina, que se excita y pierde un electrón, reduciendo al oxígeno a ión superóxido. El ión superóxido pierde un electrón, con participación de metionina como catalizador de la oxidación del ión (O₂.-), y reduce el nitro blue tetrazolium (NBT) a blue formazán. En presencia de SOD el incremento de color del NBT, disminuye porque la enzima dismuta el ión superóxido. La actividad SOD se midió teniendo en cuenta su capacidad para evitar la reducción fotoquímica del NBT.

A la mezcla de reacción se le agregó la muestra y luego riboflavina, se incubó bajo luz UV durante 9 minutos y fue registrada con espectrofotómetro la densidad óptica (DO) a 560 nm.

La actividad de la SOD fue calculada en base a la fórmula 14.

Actividad SOD =

DOt. / DOm.

-1 (14)

DOt. = densidad óptica del control.

DOm. = densidad óptica de la muestra.

Esta información se utilizó para calcular en cada muestra la actividad SOD específica, en base a la fórmula 15.

SOD específica =

Act. SOD / Cont. prot.

= U sod. mg⁻¹ (unidades SOD mg⁻¹) (15)

Act. SOD = actividad SOD obtenida de fórmula 14.

Cont. prot. = contenido de proteína de la muestra.

Una unidad SOD se define como la cantidad de enzima que evita en un 50 % la reducción fotoquímica del NBT.

Determinación de actividad SOD en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (ND-PAGE)

En un gel de poliacrilamida 30:0,8 al 12 % se cargaron 40 µg de proteína extraída de hoja 17 por calle, en una proporción 2:1 con el buffer de carga (azul de bromofenol 0,25 %, xileno cyanol 0,25 %, glicerol 30 %). La corrida se desarrolló durante 2 h a 64 mA constantes. Previo al revelado de la actividad enzimática, los geles fueron preincubados durante 20 minutos en agua destilada (control), H₂O₂ 5 mM (inhibidor de las isoformas Cu-Zn SOD y Fe-SOD) o KCN 5 mM en buffer Tris-HCl 50 mM pH 7,8 (inhibidor de la isoforma Cu-Zn SOD). Luego de este tiempo se lavaron los geles con agua destilada y se realizaron dos incubaciones sucesivas en oscuridad, en una solución de NBT (0,5 mg/ml) durante 25 minutos y luego en buffer KPO₄ 25 mM pH 7,8 conteniendo 27 µl de TEMED cada 20 ml y riboflavina 50 ppm durante 20 minutos. Pasado este tiempo, los geles fueron lavados con agua destilada y colocados en presencia de luz hasta la aparición de las bandas.

b) Determinación de actividad de la enzima catalasa (CAT):

La determinación de la actividad CAT se realizó según Gallego et al. (1996); basada en la disminución de la DO a 240 nm en la mezcla de reacción, atribuida a la disminución del H₂O₂ por la actividad de la CAT. Las lecturas se registraron durante 60 segundos.

Para calcular la actividad CAT específica, se utilizó la fórmula (16), que tiene en cuenta el coeficiente extinción molar del peróxido: 43,6 mM • cm⁻¹.

(16) CAT = (

pendiente DO / 43,6 mM • cm⁻¹

• 1000) / P = moles H₂O₂ μ g/P o nmoles H₂O₂ μ g/P.

P = contenido de proteínas en la muestra.

1 unidad CAT cataliza 1 micromol de H₂O₂ por minuto (a 25 ºC y pH 7).

c) Medición de actividad de la enzima ascorbato peroxidasa (APX):

La actividad APX se determinó según la técnica de Nakano y Asada (1981). El fundamento de la técnica plantea que la enzima reacciona con el sustrato (H₂O₂); y con el agregado de ácido ascórbico que es consumido en la reacción. Se observa una disminución de DO del sustrato, a mayor disminución de DO, mayor actividad APX.

Para calcular la actividad APX específica, se utilizó la fórmula 17, que tiene en cuenta el coeficiente extinción molar del ascórbico: 2,8 mM • cm⁻¹.

(17) APX =

(DO problema • 1000 ml) / E (2,8 mM cm⁻¹)

/ P = Mmol/ µg

E = Coeficiente de extinción molar del H₂O₂.

P = contenido de proteínas en la muestra.

En todos los casos anteriores, el contenido de proteínas se determinó según la técnica de Bradford (1976), utilizando Coomassie G-250, que tiñe de una tonalidad azul a la proteína, cuya intensidad fue determinada en lector de microplacas a 595 nm. Y la curva patrón fue realizada con albúmina bovina sérica (BSA).

3.2.6. Determinación de iones Na+ y K+ en hojas

Las hojas cosechadas a un PI cercano a 21 fueron utilizadas para la determinación de Na+ y K⁺. Las muestras, con un peso fresco cercano a 0,1 g fueron colocadas en un tubo Eppendorf, luego se agregó 1 ml de agua tridestilada y se congeló en freezer hasta el día de la medición. Para la determinación de Na⁺ y K⁺, se descongeló la muestra a temperatura ambiente, luego se agitó durante 30 segundos y finalmente se centrifugó por 3 minutos a 10.000 rpm. Las determinaciones fueron realizadas en fotómetro de llama Crudo Caamaño, modelo Ionometer Alfanumérico. Los resultados se expresaron en µmol de ion g⁻¹ de peso fresco. Los resultados fueron evaluados por ANOVA y las diferencias de medias por Tukey (p≤ 0,05).

3.3. Resultados

3.3.1. Expresión de tipburn en las variedades Sunstar y Pontina, en relación a alteraciones locales en la concentración de Ca²⁺

Como sucedió en las experiencias previas, las plantas de lechuga que crecieron en ausencia de salinidad (controles) no presentaron síntomas. Bajo estrés salino (NaCl 50 mM), el tipburn se expresó solo en Su, y la incidencia (IT) fue del 84 %. A partir del sexto ensayo, y como sucedió en los anteriores las primeras hojas en expresar síntomas, variaron entre la número 17 y 19, éstas se presentaban con pequeñas áreas necróticas que posteriormente se expandieron (figura 7).

Figura 7: Síntomas de tipburn en sucesivas hojas de lechuga, en la variedad Sunstar, en condiciones de estrés salino (50 mM de NaCl).

El tipburn observado, a un PI de 23,5.

El tipburn fue asociado con disminuciones locales de la concentración de Ca²⁺ (Barta y Tibbitts, 2000), se asumió que la alteración de tales concentraciones conducirían a una expresión diferencial de los síntomas. El secuestro local de Ca²⁺ por aplicaciones tópicas de EGTA en los márgenes de la hoja 17 de Po y Su a PI de 20, modificó la expresión de los síntomas, originando necrosis tanto en el tratamiento control como el salino (figura 8). El mayor efecto de la aplicación se observó en Su, ya que hubo un incremento en las necrosis en comparación con Po (hasta 5 veces en el tratamiento control y salino). En ausencia de salinidad, la incidencia de los síntomas en los tratamientos con EGTA fue de 60 % y 36 % para Su y Po respectivamente, y de un 92 % y 44 % en los correspondientes tratamientos salinos. A fin de determinar si el tratamiento con EGTA tenía un efecto ocasionado por la alcalinidad de la solución (pH 7,8), se aplicó en el margen de la lámina una solución de NaOH pH 7,8, que no indujo síntomas de tipburn en la zona aplicada. En Su el tratamiento salino presentó necrosis cercanas al 0,6 % de la superficie foliar. El tratamiento con EGTA, incrementó el porcentaje de necrosis en el tratamiento control y salino de Po y Su (figura 9).

Figura 8: A y B Síntomas de tipburn posteriores a la aplicación de EGTA en los márgenes de la hoja 17.

A.

B.

El EGTA (50 mM) fue suministrado a un PI de 20 y los síntomas fueron evaluados a un PI de 23,5. (a-d) Síntomas de tipburn. a. Pontina control; b. Sunstar control; c. Pontina salinizada (50 mM NaCl) y d. Sunstar salinizada (50 mM NaCl).

Figura 9: Porcentaje de área foliar afectada por tipburn, posterior a la aplicación de EGTA en los márgenes de la hoja 17.

El EGTA (50 mM) fue suministrado a un PI de 20 y los síntomas fueron evaluados a un PI de 23,5. Evaluado en plantas de lechuga de las variedades Pontina y Sunstar, cultivadas en ausencia (control) o salinizadas con NaCl (50 mM). Datos promedio ± error estándar (n=6). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05).

La aplicación tópica de bloqueantes de canales Ca²⁺ modificó la expresión de tipburn. El LaCl3 (10 mM) en los márgenes ocasionó un incremento importante de tejido necrótico que no se relacionó con el tipburn (figura 10). Los síntomas en general fueron daño severo y muerte de tejidos.

Figura 10: A y B Necrosis posterior a la aplicación de LaCl₃ en los márgenes de la hoja 17.

A.

B.

El LaCl₃ (10 mM) fue suministrado a un PI de 20 y los síntomas fueron evaluados a las 24 h posteriores. (a-d) Necrosis foliares. a. Pontina control; b. Sunstar control; c. Pontina salinizada (50 mM NaCl) y d. Sunstar salinizada (50 mM NaCl).

En los controles de ambas variedades, el La3+ ocasionó un mayor efecto (diferentes tipos de necrosis y muerte de tejidos). Aunque el efecto del LaCl3 en los tratamientos salinos en Po y Su fue similar y con menor daño que los controles (durante las 24 h posteriores a la aplicación) a las 36 h ambas variedades presentaron muerte foliar. En el tratamiento control + La³⁺ de Su fue el que originó mayor porcentaje de necrosis foliar, cercanos al 7 % (figura 11). Po tuvo menor porcentaje de necrosis foliar que Su en los tratamientos control y salino.

Figura 11: Porcentaje de área foliar con necrosis, posterior a la aplicación de LaCl₃ en los márgenes de la hoja 17.

El LaCl₃ (10 mM) fue suministrado a un PI de 20 y los síntomas fueron evaluados a las 24 h posteriores. Evaluado en plantas de lechuga de las variedades Pontina y Sunstar, cultivadas en ausencia (control) o salinizadas con NaCl (50 mM). Datos promedio ± error estándar (n=6). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05).

Figura 12: A y B Síntomas de tipburn posteriores a la aplicación de verapamil (10 mM) y un ionóforo de Ca²⁺ (A 23187, 5 μM) + Ca²⁺ (1 mM), en los márgenes de la hoja 17.

A.

B.

Los tratamientos fueron suministrados a un PI de 20 y los síntomas fueron evaluados a un PI de 23,5. (a-d) Síntomas de tipburn. a. Pontina NaCl + verapamil; b. Sunstar NaCl + ionóforo + Ca²⁺, c. Sunstar control + verapamil y d. Sunstar NaCl + verapamil.

El verapamil, otro bloqueante de canales Ca²⁺, indujo síntomas en los tratamientos salinos pero no en los controles; en el tratamiento salino Po presentó síntomas, esta variedad normalmente no los manifestaba (figura 12). Se observó necrosis en los tratamientos salinos de ambas variedades con la aplicación de verapamil, pero en el caso de Su el porcentaje de necrosis fue levemente superior al tratamiento salino, pero no hubo diferencias significativas entre ambos tratamientos (figura 13).

Contrariamente a las necrosis generadas por los tratamientos que disminuyeron localmente la concentración de Ca²⁺, no se observaron síntomas significativos de tipburn en las experiencias en que se aplicó ionóforo + 1 mM de Ca²⁺ en el margen de la hoja (figuras 12 y 13). Es decir que el incremento en la concentración local de Ca²⁺, por este tratamiento, impidió la manifestación de síntomas en plantas de Su cultivadas en condiciones salinas.

Figura 13: Porcentaje de área foliar afectada por tipburn luego de la aplicación tópica de verapamil (10 mM) y ionóforo (5 μM) + Ca²⁺ (1 mM) en los márgenes de la hoja 17, suministrado a un PI de 20 y los síntomas fueron evaluados a un PI de 23,5.

Evaluado en plantas de lechuga de las variedades Pontina y Sunstar, cultivadas en ausencia (control) o salinizadas con NaCl (50 mM). La flecha indica la reducción del tipburn en el tratamiento salino de Sunstar a partir del suministro de Ca²⁺. Datos promedio ± error estándar (n=6). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05).

Los resultados precedentes muestran que los cambios locales en Ca²⁺ pueden alterar los síntomas del tipburn, incluso en Po que no expresa tipburn en condiciones salinas.

3.3.2. Síntomas de tipburn, especies reactivas del oxígeno y estrés oxidativo

Las necrosis en los márgenes de las hojas podrían estar vinculadas con las EROs, las cuales incrementan en condiciones de estrés (Mittler, 2002) y pueden ocasionar la muerte celular (Thorsten, 1999). La presencia de O₂.- en los controles fue prácticamente imperceptible (figura 14a y d). En ambas variedades a un PI cercano a 21 el tratamiento salino incrementó la presencia y distribución del O₂.- (figura 14b y e).

Figura 14: Tinción con NBT para la localización de O₂.- en hoja 17 en lechugas de las variedades Sunstar y Pontina a un PI cercano a 21, momento anterior al desarrollo de síntomas. (a-c) Pontina; (d-f) Sunstar; (a y d) control; (b y e) tratamientos salinos con NaCl 50 mM; (c y f) NaCl 50 mM + EGTA 50 mM.

Las imágenes fueron digitalizadas en escala de grises, y transformadas en blanco y negro.

Cuando las imágenes de las hojas provenientes de plantas salinizadas fueron transformadas de la escala de grises a blanco y negro, se observó que la variedad susceptible Su presentaba mayor intensidad en la tinción que la variedad tolerante Po (figura 14b y e). En Su se observó una mayor acumulación de formazán en los bordes de la base de la hoja que en la parte apical. En el tratamiento salino; en Su la zona con mayor intensidad en la tinción es donde con posterioridad se observan síntomas de tipburn (figura 14e). Cuando se aplicó EGTA en los márgenes, la zona presentó mayor intensidad y distribución en la tinción (figura 14c y f).

3.3.3. Efectos de la salinidad y del secuestro del Ca²⁺, sobre la peroxidación de lípidos de membrana en relación a la manifestación de tipburn

La técnica de MDA permitió evaluar si existe daño oxidativo previo a la aparición de los síntomas. En ambas variedades los tratamientos salinos presentaron una mayor acumulación de MDA que los controles, pero no existieron diferencias entre ellas (figura 15).

Los tratamientos con EGTA, que condujeron a la manifestación de síntomas de tipburn, incrementaron el MDA con respecto a los tratamientos sin EGTA, y Po presentó menor concentración de MDA que Su; sugiriendo un menor daño de membranas celulares.

Figura 15: Efecto del tratamiento salino y de la aplicación tópica con EGTA en los márgenes de la hoja, sobre la peroxidación de lípidos de membrana.

Datos tomados en hoja 17 a un PI cercano a 21. Datos promedio ± error estándar (n=5). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05). Test DMS.

3.3.4. Efectos de la salinidad y del secuestro del Ca²⁺, sobre el daño de las membranas celulares en hojas (DMC)

La técnica de Sullivan permitió evaluar el daño ocurrido en las membranas celulares a causa de los diferentes tratamientos. En condiciones de salinidad Po acusó una menor pérdida de electrolitos de membrana que Su (p≤ 0,05). El tratamiento salino con un reducido suministro de Ca²⁺ (0,5 mM) en la solución nutritiva no indujo un mayor DMC en ninguna de las dos variedades (figura 16).

Figura 16: Efecto del tratamiento salino y de la aplicación tópica con EGTA en los márgenes de la hoja, sobre el daño en las membranas celulares.

Datos tomados en hoja 17 a un PI cercano a 21. Datos promedio ± error estándar (n=5). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05). Test DMS.

Los tratamientos con EGTA incrementaron el DMC en ambas variedades (p≤ 0,05); Po acusó mayor pérdida de electrolitos cuando el suministro de Ca²⁺ fue de 0,5 mM, pero un porcentaje muy inferior con respecto a Su. Cuando fueron comparadas la variedades individualmente, los tratamientos con EGTA fueron los que registraron mayor DMC (p≤ 0,05), y en ambas variedades se manifestó síntomas de tipburn.

3.3.5. Efecto de la aplicación de antioxidantes en la manifestación del tipburn

Dado que la expresión del tipburn indicó estar asociada con la producción de EROs, se hipotetizó que el secuestro o la inhibición de las fuentes de EROs mitigaría la expresión de síntomas. Esto fue evaluado en el cultivar Su, que expresa síntomas en condiciones de salinidad. Las aplicaciones tópicas con tiron, un secuestrador de EROs, redujo el área afectada por tipburn (figura 17). En ensayos previos, las hojas adyacentes a la 17 también manifestaron síntomas en los tratamientos con NaCl; en la figura 17a, la hoja de Su del tratamiento salino tratada con DPI (la de mayor tamaño) no presentó síntomas, mientras que las hojas más jóvenes de la misma planta, pero no tratadas, manifestaron síntomas; en la figura 2 del apéndice se observan las fotografías en colores.

Figura 17: Efecto de la aplicación tópica de antioxidantes en la expresión de tipburn en los tratamientos con 50 mM NaCl en la variedad Sunstar.

Síntomas evaluados en la hoja 17, 24 h posteriores a la aplicación de antioxidantes en el margen de la hoja. (a) tratada con 50 µM de DPI. Las hojas 19-21 de la misma planta no fueron tratadas y desarrollaron síntomas. (b) tratada con 50 mM de tiron. (c). Porcentaje de área foliar afectado por tipburn en los tratamientos mencionados y sus controles. Datos promedio ± error estándar (n=6). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05). Test DMS.

3.3.6. Actividad de enzimas antioxidantes en respuesta a tratamientos salinos en variedades que difieren en susceptibilidad al tipburn

Los síntomas de tipburn se manifestaron inicialmente en la base de las hojas, por lo que la actividad enzimática fue analizada en márgenes apical y basal, a un PI anterior a la manifestación de tipburn, a fin de determinar si la aparición de síntomas se relaciona con cambios locales en la actividad antioxidante.

Se observó un incremento en la actividad de SOD en salinidad, más notablemente en la base de la hoja de Po (figura 18). Los tratamientos con EGTA, que manifestaron síntomas, presentaron mayor actividad SOD, el aumento de la presencia de superóxido (figura 14) y el daño oxidativo (figuras 15 y 16), también incrementaron la actividad de SOD, y, de nuevo, más en Po que en Su.

No se observaron diferencias en la actividad SOD, entre tratamientos a los que se les suministró distinta concentración de Ca2+ en la solución nutritiva.

Las hojas en ambas variedades, incrementan la actividad SOD, en los márgenes de la base con respecto al ápice cuando se secuestró el Ca²⁺ con EGTA (figura 18).

La actividad enzimática, en los tratamientos con respecto a los controles incrementaron, y oscilaron entre un 47 a 500 %. En los tratamientos con NaCl el incremento osciló entre un 100 y 250 %; mientras que en los tratamientos con EGTA el incremento fue de hasta un 520 %.

Figura 18: Actividad de SOD en el ápice y en la base en hojas de lechuga en los tratamientos control y salinos (50 mM NaCl), con y sin la aplicación tópica con 50 mM EGTA.

Los tratamientos se efectuaron en la hoja 17 a un PI de 20, y la actividad enzimática fue medida a las 24 h posteriores. Datos promedio ± error estándar (n=7). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05).

3.3.7. Determinación de actividad SOD en gel de poliacrilamida no desnaturalizante (ND-PAGE)

La actividad SOD fue determinada en las variedades Po y Su en gel de poliacrilamida, con el objetivo de visualizar la isoforma de la enzima que presentó una repuesta significativa en los tratamientos que originaron tipburn. Las determinaciones fueron realizadas en la base de la hoja 17 (figura 19 en Po y figura 3 del anexo en Su).

Como se observa en la figura 18 los tratamientos con NaCl y NaCl + EGTA en la base de la hoja de Po fueron los de mayor actividad (calles 3 y 4 de la figura 19a).

La aplicación de H₂O₂ originó una inhibición parcial de la actividad (figura 19b) y el KCN ocasionó una inhibición casi total en la actividad SOD (figura 19c), por lo que es probable que en la respuesta ante el estrés oxidativo esté involucrada la actividad de la CuZn-SOD que es inhibida por ambos compuestos.

Los tratamientos con NaCl, incrementaron la actividad de APX en Su (figura 20), el incremento en la actividad APX resultó mayor con el agregado de EGTA en los márgenes, y los incrementos fueron mayores en Po; en general en Su y Po no existieron diferencias significativas entre ápice y base.

Figura 19: Actividad de SOD en geles de poliacrilamida transformados en escala de grises (a-b-c) en función de los tratamientos.

Calle 1: control, calle 2: control + EGTA (50 mM), calle 3: NaCl (50 mM) y calle 4: NaCl (50 mM) + EGTA (50 mM); a. sin inhibidor, b. con H₂O₂ (5 mM) como inhibidor de las isoformas CuZn-SOD y Fe-SOD; y c. con KCN (5 mM) como inhibidor de la isoforma CuZn-SOD en los márgenes de la base en la hoja 17 a un PI cercano a 21,5 en lechuga de la variedad Pontina.

Figura 20: Actividad de APX en el ápice y en la base en hojas de lechuga en los tratamientos control y salinos (50 mM NaCl), con y sin la aplicación tópica con 50 mM EGTA.

Los tratamientos se efectuaron en la hoja 17 a un PI de 20, y la actividad enzimática fue medida a las 24 h posteriores. Datos promedio ± error estándar (n=7). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05).

Un mayor nivel de actividad CAT fue inducido en Su (figura 21) en comparación con Po, probablemente inducido por el H₂O₂ producto de la actividad de SOD. Por lo tanto, las condiciones que conducen a la expresión diferencial de los síntomas en ambas variedades, fueron acompañadas por una mayor actividad de SOD y APX en el genotipo tolerante al tipburn.

Figura 21: Actividad de CAT en el ápice y en la base en hojas de lechuga en los tratamientos control y salinos (50 mM NaCl), con y sin la aplicación tópica con 50 mM EGTA.

Los tratamientos se efectuaron en la hoja 17 a un PI de 20, y la actividad enzimática fue medida a las 24 h posteriores. Datos promedio ± error estándar (n=7). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05).

Los tratamientos incrementaron la actividad CAT con respecto a los controles entre un 95 a 395 %. En los tratamientos con NaCl el incremento fue entre un 95 y 213 %; mientras que en los tratamientos con EGTA el incremento fue de hasta un 395 %.

Se observó que a niveles generales, no existieron en SOD, APX y CAT diferencias en un mismo tratamiento en los cuales se les suministró una concentración de (2,5 mM) ó (0,5 mM) de Ca2+ en la solución nutritiva.

3.3.8. Efecto de los tratamientos salinos sobre la concentración de sodio y potasio en láminas foliares

La concentración foliar de Na⁺ en los tratamientos con NaCl 50 mM fue mayor en Su que en Po (tabla 12). No existieron diferencias en la concentración de Na⁺, con el agregado de EGTA en hojas de los tratamientos salinos (p> 0,05).

Se observó una similar concentración foliar de K+ en los controles de ambas variedades. En los tratamientos con NaCl 50 mM, se observó que la concentración de K⁺ aumentó en Po con relación al control; Su presentó una menor concentración de K⁺ (p≤ 0,05) que Po (tabla 12). En ambas variedades, no hubo diferencias en la concentración de K⁺, con el agregado de EGTA.

Tabla 12: Concentración de Na+ y K⁺ (µmoles g⁻¹ de peso fresco) y relación K⁺/Na⁺, en hojas en los diversos tratamientos salinos, con ó sin pincelado con EGTA en los márgenes.

Tratamientos

µmoles Na⁺ g⁻¹.

µmoles K⁺ g⁻¹.

Relación K⁺/Na⁺

Control Sunstar

6,37 a

61,57 a

9,69 c

Control Pontina

6,68 a

70,58 ab

10,62 c

Control Sunstar + EGTA

6,53 a

91,49 abc

14,08 d

Control Pontina + EGTA

6,47 a

91,12 abc

13,94 d

NaCl Sunstar

89,69 c

118,78 cde

1,30 a

NaCl Pontina

29,90 b

157,13 f

4,84 b

NaCl Sunstar + EGTA

96,6 c

121,29 cdef

1,26 a

NaCl Pontina + EGTA

31,86 b

141,50 ef

4,65 b

En las variedades Sunstar y Pontina, en la hoja 17. Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05).

Las relaciones K⁺/Na⁺ en los controles, fueron las más elevadas y no existieron diferencias (p> 0,05) entre variedades. En los tratamientos con NaCl 50 mM (con y sin EGTA), las relaciones K⁺/Na+ fueron menores que los controles a causa de una mayor concentración de Na⁺ propia de los tratamientos salinos.

El resultado de relevancia, es la diferencia en la relación entre variedades, por lo que en la variedad tolerante al tipburn la relación K⁺/Na+ fue mayor (p≤ 0,05) que en la susceptible; se mantuvo la relación con el agregado de EGTA en los márgenes.

3.4. Discusión

3.4.1. Ca²⁺, estrés salino y relación con el tipburn

El tipburn es atribuido generalmente a deficiencias de Ca²⁺ en hojas jóvenes en activo crecimiento (Collier y Tibbitts, 1982), habiéndose descripto una correlación negativa entre la incidencia de tipburn, el contenido de Ca²⁺ y la distribución foliar de este elemento (Saure, 1998). Como se observó en los resultados del capítulo II en condiciones de salinidad existió una relación de la enfermedad con la menor disponibilidad de Ca²⁺, por este motivo se realizaron todos los experimentos utilizando una baja concentración de Ca²⁺ para asegurar la manifestación de síntomas.

Aunque se ha observado una coincidencia entre la expresión de tipburn con la reducción en las concentraciones locales de Ca²⁺, este aspecto no había sido probado experimentalmente. Se realizaron tratamientos con la finalidad de disminuir o aumentar el suministro de Ca2+ a las células de los márgenes de las hojas de lechuga, zona en la que potencialmente se expresa el tipburn. Los tratamientos con EGTA (quelante de Ca²⁺) no solamente incrementaron los síntomas de tipburn en los tratamientos salinos, sino que también los indujeron en los controles, incluso en hojas de la variedad tolerante Pontina, aunque con menor incidencia que en Sunstar. Por otra parte Tzortzakis (2009) observó en endibia y lechuga cultivadas en condiciones de salinidad que la aplicación foliar de sprays con sales de Ca²⁺ no modificó el crecimiento, pero sí fue efectiva en la protección contra el tipburn. Resultados coincidentes se obtuvieron en el presente estudio cuando el Ca²⁺ fue aportado localmente en el borde de la hoja junto con un ionóforo (A.23187) + 1 mM Ca²⁺ que evitó la manifestación de síntomas (figura 13).

En contraste con otros macronutrientes, la mayor proporción del Ca²⁺ se encuentra en la pared celular unido a grupos carboxílicos que poseen carga negativa como los ácidos galacturónicos (pectinas), y los oxalatos (Marschner, 1995). Altas concentraciones de este elemento pueden ser almacenadas en organelas como el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi, pero principalmente se lo almacena en la vacuola, cuya membrana posee mecanismos de transporte que permiten mantener la homeostasis del Ca²⁺ en el citosol, donde la concentración oscila entre 0,1-0,2 µM (Conn et al., 2011). Un incremento significativo del Ca²⁺ citosólico puede originar la muerte celular (Hirschi, 2004), el exceso de Ca²⁺ en el citosol se elimina de manera activa a través del transporte catalizado por Ca²⁺-ATPasas y antiportes-H⁺/Ca2+ (Hirschi, 2001). Por otro lado la deficiencia de Ca²⁺ en el citosol también puede originar la muerte celular, Hirschi (2001) observó en plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresaban el gen AtCAX1 que codifica un antiporte-H⁺/Ca²⁺ ubicado en vacuola, involucró la aparición de desordenes fisiológicos relacionados con la deficiencia de Ca²⁺ como tipburn, situación que se revirtió experimentalmente a través del suministro de Ca²⁺.

Los flujos de Ca²⁺ requeridos para generar señales en el citosol tienen una duración de minutos comparados con los necesarios para una adecuada nutrición, ambos flujos pueden estar comprometidos en las enfermedades relacionadas con las deficiencias de Ca²⁺ (White, 2001). Cabe recordar que el Ca²⁺ ejerce su acción en diversos compartimientos celulares. En el citoplasma actúa regulando la actividad de la NAD quinasa y la Δ¹-pirrolina-5-carboxilato sintetasa (Delumeau et al., 2000). En plantas las proteínas quinasas, la calmodulina y las proteínas AtCBLs son dependientes del Ca²⁺ y las principales candidatas para iniciar las cadenas de reacciones activadas por la variación de la concentración del Ca²⁺ en el citosol (Evans et al., 2001). En plantas tolerantes al tipburn, cambios en estas proteínas podrían estar directa o indirectamente vinculados en la regulación de la respuesta al estrés salino y al tipburn.

El transporte del Ca²⁺ a través de la membrana plasmática está mediado por varias clases de canales, incluyendo: 1- canales dependientes del voltaje (voltage-operated channels, VOC), 2- los dependientes de mensajeros secundarios para su apertura (second messenger-operated channels, SMOC), 3- los que están relacionados con la concentración de Ca2+ en el apoplasto (store-operated channels SOC), y 4- los activados a través de un receptor (receptor-operated channels ROC). Los VOCs son activados por polarización o despolarización de la membrana, los SMOCs son activados por una o algunas pequeñas moléculas mensajeras (IP3, nucleótidos cíclicos y mensajeros lipídicos derivados). Los SOCs son activados por una disminución del Ca²⁺ intracelular, los ROCs son activados por la unión directa con una molécula y/o hormona (Parekh y Putney, 2005). El verapamil es conocido por bloquear los canales VOCs (Davenport y Tester, 2000). Hubo síntomas de tipburn con la aplicación de verapamil en el tratamiento salino de Pontina, por lo que la manifestación de tipburn podría estar relacionada con el transporte del Ca²⁺ por este tipo de canales. El LaCl₃ bloquea todos los canales mencionados anteriormente, y la sintomatología en los experimentos no fue la típica del tipburn, el efecto que provocó este bloqueante en toda la hoja podría estar relacionado con una interferencia generalizada en el metabolismo celular. Esto podría explicar porqué el efecto del LaCl₃ fue más evidente en los controles, que tenían una tasa de crecimiento mayor, y por ende mayores requerimientos de Ca²⁺.

Estos resultados confirman experimentalmente la hipótesis de que el tipburn está relacionado con la disminución local del Ca²⁺ ya que su secuestro promovió la manifestación de síntomas y su suplemento la mitigó. Por otra parte el hecho de que el EGTA provocara síntomas en la variedad tolerante Pontina pero que estos fueran de menor magnitud que en la susceptible Sunstar sugiere la presencia de mecanismos de tolerancia al tipburn en la primera.

3.4.2. EROs y expresión del tipburn

Una respuesta común al estrés salino y a otros tipos de estrés es el incremento de EROs (Mittler et al., 2004), pero aún no se había investigado si existe una contribución de las EROs a la manifestación del tipburn. En coincidencia con la mayor predisposición de Sunstar a la manifestación de tipburn en el tratamiento salino, se observó también mayor pérdida de electrolitos en tejidos, la producción de MDA (figura 15) y mayor contenido de O₂.- (figura 14) en esta variedad que en la tolerante. El incremento de O₂.- se verificó en la zona donde luego se haría evidente la manifestación de los síntomas de tipburn (figura 14). Estos resultados sugirieron que la manifestación de los síntomas está vinculada al estrés oxidativo, aspectos sobre el cual no existían antecedentes previos.

El aumento en las EROs en los tratamientos salinos puede conducir al daño en membranas por la peroxidación de lípidos (Yan et al., 1996; Vranova et al., 2002). En estudios previos en lechuga y bajo condiciones de salinidad se observó un incremento en MDA, asociado específicamente con las EROs involucradas en la peroxidación de lípidos de membrana (Eraslan et al., 2007).

La aplicación tópica de EGTA ocasionó una mayor producción y distribución de superóxido en toda la hoja, y el consecuente incremento de la concentración de MDA, por lo que se concluyó que la baja disponibilidad de Ca²⁺ está relacionada con el desarrollo del estrés oxidativo durante la manifestación del tipburn. En coincidencia con estos resultados, se observó una relación entre la deficiencia de Ca²⁺ y el estrés oxidativo en hojas de tomate (Schmitz-Eiberger et al., 2002). En el presente trabajo se obtuvieron pruebas experimentales de la asociación entre ambos.

La aplicación del antioxidante tiron ocasionó una reducción de un 70 % en las necrosis en los márgenes de las hojas en el tratamiento salino, este efecto es una evidencia adicional del vínculo de las EROs con el tipburn. La NADPH oxidasa de membrana que se encuentra en la membrana celular en mamíferos y también en plantas (Levine et al., 1994), participa en la generación de superóxido en el apoplasto, y el DPI es un inhibidor de su actividad. En condiciones de salinidad no se manifestaron síntomas de tipburn en hojas tratadas con DPI, mientras que en las hojas contiguas, si los hubo (figura 17a), sugiriendo que el O₂.- generado por la NADPH oxidasa de membrana podría estar involucrado en la manifestación de los síntomas. Ambos resultados referidos al efecto de antioxidantes refuerzan el vínculo del tipburn con el estrés oxidativo.

El daño oxidativo se relacionó con la actividad de la NADPH oxidasa de membrana por la respuesta a su inhibición con DPI. Es conveniente remarcar en este punto que si bien el DPI puede inhibir a otras enzimas, tales como peroxidasas, la concentración empleada en los experimentos de esta tesis (50 µM) se considera que inhibe específicamente a la NADPH oxidasa de membrana (Bolwell, 1992). En el presente estudio no se abordó qué miembros de la familia NOX (NADPH oxidasas) a la cual pertenece la NADPH oxidasa de membrana, están involucrados en este efecto. Sería relevante dilucidar cuál/es enzima/s NOX (y sus isoformas) se activarían durante la manifestación del tipburn ya que los miembros NOX5, DUOX1 y DUOX2 son activados por el Ca²⁺ mientras que el resto (NOX1, NOX2, NOX3, NOX4) no son activados con la unión del Ca²⁺. Aunque el Ca²⁺ no se acople a estos últimos no quiere decir que las señales Ca²⁺ indirectamente no los activen, ya que además de participar en numerosos procesos fisiológicos todos los miembros de la familia NOX están vinculados con la señalización celular (Bedard y Krause, 2007), al igual que el Ca²⁺.

Existen antecedentes de la vinculación de EROs con otras patologías que implican necrosis foliares en lechuga. Diferentes patovares de Pseudomonas syringae (P.s) originan necrosis foliares localizadas como consecuencia de incrementos de H₂O₂ y de la actividad de la NADPH oxidasa de membrana (Bestwick et al., 1997; Bestwick et al., 1998). Estos antecedentes acerca de la implicancia de incrementos en la actividad de la NADPH oxidasa de membrana en la generación de necrosis foliares en lechuga, refuerza la posibilidad de participación de esta enzima en la manifestación del tipburn, como lo sugieren los resultados de esta tesis.

La salinidad ocasiona un incremento de EROs en el apoplasto (Hernández et al., 2001). El Ca²⁺ fijado en la pared celular actúa como reservorio que es liberado si hay un incremento de las EROs (Kawano y Muto, 2000), originando un aumento en la concentración del Ca²⁺ debido a la peroxidación de las moléculas que conforman la pared, liberando el Ca²⁺ hacia el apoplasto. Si bien la salinidad disminuye el transporte de Ca²⁺ hacia los tejidos, en estas condiciones, se observó en el citosol un incremento significativo del Ca²⁺ proveniente del apoplasto a causa del un estrés oxidativo originado por la salinidad (White, 2003). Este Ca²⁺ liberado ingresa al citosol y en forma conjunta con el interno participa en los procesos que originan señales de respuesta al estrés (Sanders, 2002). Otro de los efectos de la salinidad vinculados con el Ca²⁺, es su participación en los mecanismos celulares que median la expulsión y/o compartimentalización del Na⁺ (Shi et al., 2000); por ejemplo la activación de la apertura de canales del tipo SOS (Shi et al., 2002), que está mediada por un incremento en la concentración de Ca²⁺ citosólico proveniente del apoplasto (Zhu, 2000).

En otros compartimentos celulares, además del apoplasto, también se generan EROs durante el estrés salino, ya que se observó un incremento de EROs mitocondriales en papa y en arveja a causa de que la salinidad estimuló el transporte de electrones en las partículas submitocondriales (Sjölin y Møller, 1991; Hernández et al., 1993) y las EROs originaron peroxidación de lípidos de la membrana mitocondrial (Hernández et al., 1993); también se observó un incremento de H₂O₂ en cloroplasto que originó la peroxidación de lípidos (Hernández et al., 1995). Es probable que las EROs originadas en diversos compartimentos celulares también estén vinculadas con el estrés oxidativo que desencadenó el tipburn.

Es posible que el tipburn sea originado por otras fuentes de EROs no evaluadas en este trabajo, por ejemplo la actividad de las enzimas poliaminas oxidasas (PAOs) y amino oxidasas (AOs) que originan H₂O₂ en el apoplasto, se observó que la actividad de éstas enzimas se incrementó durante el estrés salino (Alcázar et al., 2010); las aminas y poliaminas provenientes del metabolismo celular son utilizadas como sustrato y originan un compuesto carbonado y H₂O₂, este último generó daño oxidativo y muerte celular (Angelini et al., 2010) y también podría participar en la generación de tipburn.

3.4.3. Tipburn y el sistema antioxidante

El estrés oxidativo se origina por un desequilibrio entre la producción de EROs y la capacidad del sistema biológico de detoxificar rápidamente las EROs y/o reparar el daño ocasionado. La actividad de los antioxidantes tienen el mayor papel en controlar el nivel de las EROs y un potencial estrés oxidativo, no solo durante el estrés abiótico o biótico si no también durante el normal funcionamiento del metabolismo celular (Foyer y Noctor, 2005; Gill y Tuteja, 2010). En pimiento el secuestro apoplastico de EROs por la aplicación de antioxidantes mitigó la manifestación de BER (Aktas et al., 2005).

Durante un estrés salino ocurre la síntesis de enzimas antioxidantes como mecanismo de respuesta al aumento de las EROs (Hernández et al., 2000; Han y Lee, 2005). Se observó en hojas de B. parviflora un incremento en la actividad SOD en función del tiempo de exposición y de la concentración de NaCl (Parida et al., 2004). En los experimentos realizados se observó un aumento de las EROs y de la actividad enzimática en ambas variedades, ya sea con salinidad como en el tratamiento con EGTA, pero en la variedad tolerante Pontina, los incrementos en actividad SOD en la base de la hoja fueron mayores que en Sunstar.

La actividad de la SOD constituye el mecanismo principal de defensa de las células contra los radicales libres y para prevenir el estrés oxidativo en plantas (Hernández et al., 2001). Este mecanismo opera también en células animales (Orr y Sohal, 1994). Se sugiere por lo tanto que la SOD tuvo un papel fundamental en la tolerancia al tipburn al mitigar el daño oxidativo en la variedad tolerante Pontina, y se observó que la CuZn-SOD fue la que presentó mayor actividad (figura 19). Hernández et al. (2001) compararon las respuestas a la salinidad en dos cv de arveja e informaron que en el más tolerante no se registraron necrosis en hojas, lo que atribuyeron a una mayor actividad de la isoforma CuZn-SOD en el apoplasto. Es posible que en lechuga la actividad SOD tenga un papel fundamental en otorgar tolerancia al tipburn. Para validarlo se podría plantear si la sobreexpresión de SOD evita la expresión de los síntomas, y por otra parte en la variedad tolerante Pontina pincelar en el margen de la hoja con algún inhibidor de la actividad SOD como es el caso del diethyldithiocarbamato (Khazaei et al., 2009), para observar si ocurren síntomas.

Aunque las SODs en una célula constituyen la primera línea de defensa contra las EROs (Scandalios, 1993) y son las más relevantes en el sistema antioxidante enzimático (Alscher et al., 2002), en el presente trabajo de tesis se plantea que la mitigación de las EROs y la menor predisposición al tipburn en lechuga no sólo dependería del complejo enzimático, sino también de la capacidad antioxidante total, por lo que sería de interés evaluar en Pontina la presencia de otros metabolitos no enzimáticos que estén relacionados con la capacidad antioxidante.

En la variedad susceptible Sunstar se observó que inhibiendo con DPI la actividad de la NADPH oxidasa de membrana se evitaban los síntomas de tipburn, por lo que las necrosis tendrían su origen en el estrés oxidativo generado en apoplasto, de modo tal que la actividad de una enzima antioxidante ubicada en tal compartimiento contribuiría a mitigar los síntomas. En la tolerancia al tipburn también podrían estar involucradas otras enzimas antioxidantes que se encuentran en el apoplasto, además de la CuZn-SOD, como se observó en plantas de arveja donde la actividad de la monodehidroascorbato reductasa (MDHAR), y de la dehidroascorbato reductasa (DHAR) también evitaron el desarrollo de estrés oxidativo (Hernández et al., 2001).

En plantas de Eribotria japonica Lind. tratadas con 50 mM de NaCl la aplicación de 25 mM de Ca2+ originó una disminución de la peroxidación de lípidos de membrana y una disminución en la actividad de CAT y APX aunque no se conocen los mecanismos que conducen a tal efecto (Hernández et al., 2003). En el presente trabajo, cuando se restringió el suministro de Ca²⁺ se observó un incremento de las actividades de CAT y APX; mientras que el agregado de Ca²⁺ en hojas a través del ionóforo evitó la aparición de síntomas en la variedad susceptible Sunstar. La posible secuencia de eventos que conducen a tal efecto sugiere que la restricción de Ca2+ originó, como se vio, estrés oxidativo, y éste haya sido el responsable del incremento en actividad de las enzimas antioxidantes (Mittler, 2002). Sin embargo, en plantas de lechuga que manifestaron tipburn, aunque se registraron incrementos en actividad de enzimas antioxidantes en presencia de menor disponibilidad de Ca²⁺, los mismos no fueron suficientes para ejercer eficazmente el efecto protector sobre el estrés oxidativo.

Los resultados con el ionóforo + 1 mM Ca²⁺ también indicaron que es efectivo aplicar Ca²⁺ de manera foliar cuando el tipburn es originado por un estrés salino. Es probable que el Ca²⁺ suministrado evite o disminuya el estrés oxidativo que se generaría por una baja concentración de este elemento y de esta manera mitigue la incidencia del tipburn.

Es conocido que las EROs participan en eventos de señalización que activan mecanismos de defensa contra el estrés biótico y abiótico (Suzuki et al., 2011). Las señales originadas por EROs pueden implicar un amplio cambio transcripcional que contribuye a la activación o desactivación de genes (Miller et al., 2010). En Arabidopsis las EROs que derivaron de la actividad de la NADPH oxidasa D (RbohD) participaron en respuestas de aclimatación en condiciones de estrés salino (Xie et al., 2011). En plantas de cítricos y arvejas el estrés salino indujo a la formación de EROs en el citoplasma y a la consecuente activación de las enzimas antioxidantes en plantas tolerantes a la salinidad (Gueta-Dahan et al., 1997; Hernández et al., 2000), por lo que es probable que la tolerancia al tipburn esté también vinculada al complejo antioxidante en el citosol. Por otro lado los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) producto de la peroxidación de lípidos de membrana, originan señales de respuesta vinculados al estrés oxidativo y a la síntesis de enzimas antioxidantes (Møller et al., 2007).

La mitigación de las EROs y la menor predisposición al tipburn en lechuga no sólo dependería del complejo enzimático, sino también de la capacidad antioxidante total. Oh et al. (2009) describieron que en lechuga existe una relación entre la activación del metabolismo secundario y antioxidante durante los procesos de adaptación a condiciones de estrés. Las variedades de lechuga rojas son generalmente menos susceptibles al tipburn (Jenni y Hayes, 2010); Llorach et al. (2008), Ozgen y Sekerci (2011) encontraron una mayor cantidad y actividad de antioxidantes en este tipo de lechugas en comparación con las variedades de color verde. Es posible que la mayor capacidad antioxidante en las hojas de las variedades de color rojo descriptas por Ozgen y Sekerci (2011) otorgue tolerancia al tipburn como se observó en la variedad tolerante Pontina.

3.4.4. Na⁺, K⁺ y expresión del tipburn

La homeostasis iónica celular y la hiperpolarización de membrana que ocurren como consecuencia de la exposición de las plantas a la salinidad (de -120 a -200 mV) (Hasegawa et al., 2000); facilita el ingreso del Na⁺ que compite con el K⁺ a causa de que comparten las mismas vías de transporte (Amtmann y Sanders, 1999). Los resultados de este trabajo indicaron que la tolerancia al tipburn de Pontina, coincidió con el mantenimiento de una menor concentración de Na⁺ en los tejidos de la hoja en condiciones de salinidad. Este mecanismo podría contribuir a la tolerancia de esta variedad al tipburn, ya que el Na⁺ tiene un efecto tóxico en la célula (Maathuis y Amtmann, 1999) y origina un incremento en las EROs apoplásticas (Munns, 2005). La relación K⁺/Na+ en Pontina, fue más elevada que en Sunstar, sugiriendo la posible presencia de mecanismos para mantener una captación selectiva de K⁺, y así conservar la concentración foliar del K⁺ alta con respecto al Na⁺ como sucede en plantas de trigo tolerantes a salinidad (James et al., 2006; Munns et al., 2006). Otra posibilidad es que existan proteínas relacionadas con las AtHKT1 y OsHKT1 como las que se encuentran en las células del parénquima del xilema en plantas de arroz (Ren et al., 2005); y mantienen una alta relación K⁺/Na⁺ en la parte aérea durante un estrés salino en esta especie. Identificar los mecanismos participantes en lechuga sería de gran importancia, para incrementar la tolerancia a salinidad (Munns y Tester, 2008). La coincidencia entre tolerancia a la salinidad y al tipburn encontrada en este trabajo sugiere que el incremento en la primera redundaría en mejorar la tolerancia al tipburn.

En conclusión la deficiencia de Ca²⁺ y la presencia de Na⁺ en los tejidos foliares, están relacionados con la susceptibilidad al tipburn. La menor concentración de Ca²⁺ en la solución nutritiva incrementó la incidencia del tipburn en plantas susceptibles; probablemente por una menor captación del Ca²⁺ en hojas jóvenes en comparación con las más viejas, como se observó en lechuga tratada con 80 mM de NaCl (Lazof et al., 1998). El secuestro local de Ca²⁺ en hojas provocó síntomas de tipburn y también estrés oxidativo. La aplicación de antioxidantes logró mitigar la sintomatología de tipburn. Estos resultados en forma conjunta sugieren un vínculo entre la deficiencia local de Ca²⁺, el estrés oxidativo y la generación de tipburn, sobre el cual no existían antecedentes.

Capítulo 4

4.1. Conclusiones generales y discusión

Los trabajos que involucran las causas que originan el tipburn se iniciaron hace unos cien años (Thompson, 1926; Wiseimeier y Zühlke, 2002). A pesar del tiempo transcurrido, la etiología del tipburn sigue siendo un misterio. El principal problema para entender esta enfermedad fisiogénica es que hay escasos aportes experimentales sobre cada uno de los factores que pueden estar relacionados con su generación. Por otra parte, debido a que las condiciones ambientales en las que se la evaluó fueron muy diversas, hay investigaciones con resultados contradictorios y no siempre es posible prevenirla en base a medidas tecnológicas (Saure, 1998; Wiseimeier y Zühlke, 2002).

El presente trabajo se centró sobre el efecto del estrés salino y el Ca2+ en la manifestación del tipburn, y se ha investigado su vinculación con el crecimiento y con el estrés oxidativo y su control.

A continuación se tratarán los resultados de la tesis en función de las hipótesis planteadas inicialmente, que se transcriben como guía de esta sección, destacándose en cada caso los aportes realizados al conocimiento. No se reiteran los comentarios que vinculan los resultados con los antecedentes sobre el tema, que ya fueron realizados en los capítulos precedentes.

1) Condiciones de salinidad y alcalinidad incrementarán la incidencia del tipburn, y en lechuga la tolerancia a la salinidad medida como respuesta relativa de crecimiento, está positivamente correlacionada con la tolerancia al tipburn.

-Se observó tipburn en condiciones de salinidad y alcalinidad, no en condiciones control (Cap. 2, tabla 3). No existían estimaciones anteriores de expresión de tipburn en condiciones de alcalinidad.

-La baja concentración de Ca²⁺ en el medio promovió la manifestación de tipburn en condiciones de salinidad (Cap. 2, tablas 5 y 6).

-Se identificaron dos variedades con incidencia diferencial de tipburn que fueron utilizadas como herramienta experimental en los experimentos subsiguientes (Cap. 2, tabla 5).

-En condiciones de alcalinidad se observaron además de tipburn síntomas de toxicidad y variabilidad en las respuestas por lo que los experimentos bajo estas condiciones no se prosiguieron (Cap. 2, figura 4).

2) El tipburn se manifiesta en hojas en activo crecimiento, por ende, la modificación de las tasas de crecimiento modificarán la expresión del tipburn.

-El tipburn ocurrió tanto en hojas que mantuvieron como en las que se redujo la TEFR, por lo que el tipburn no tuvo relación directa con las TEFR (Cap. 2, tablas 8 y 9).

-El crecimiento de la zona de la hoja donde en etapas posteriores se expresa el tipburn, fue afectado negativamente por la salinidad (Cap. 2, figura 6, y tabla 10). Estos resultados comprueban que no existe una relación unívoca entre crecimiento foliar normal y expresión de tipburn, en contraposición a lo citado en la literatura.

3) El tipburn se asocia a alteraciones en la distribución/suministro de Ca²⁺ (y otros iones) en la hoja. Por lo tanto, la manipulación de la concentración local de Ca²⁺ mediante el suministro o el secuestro, disminuirá o incrementará respectivamente la expresión del tipburn.

-Las aplicaciones tópicas en láminas foliares de un quelante de Ca²⁺ (EGTA) y de un bloqueante de canales de Ca²⁺ (verapamil) no solamente incrementaron los síntomas de tipburn en los tratamientos salinos, sino que también los indujeron en los controles, incluso en hojas de la variedad tolerante Pontina, aunque con menor incidencia que en Sunstar (figuras 8 y 12). La aplicación en el margen de la hoja del ionóforo + 1 mM Ca²⁺ evitó la manifestación de síntomas (figuras 12 y 13). Estos resultados indican que la expresión de tipburn está asociada al mantenimiento del suministro celular de Ca²⁺ desde el apoplasto.

4) La manifestación de tipburn se incrementará en función de la acumulación foliar de Na⁺.

-Hubo coincidencia entre expresión de tipburn y mayor acumulación de Na⁺ en láminas foliares en la variedad Sunstar (tabla 12). Pontina, tolerante al tipburn, acumuló menos Na⁺ en láminas foliares que Sunstar y mantuvo alta la relación K⁺/Na⁺.

5) La manifestación de tipburn resulta de la presencia de EROs en láminas foliares,

5.1) Apoplásticas, involucradas en el control del crecimiento celular e ingreso de Ca²⁺ (en células en crecimiento) o bien simplásticas o apoplásticas, que generan estrés oxidativo (en células expandidas y en crecimiento).

-En coincidencia con la mayor predisposición de Sunstar a la manifestación de tipburn en el tratamiento salino, se observó también mayor pérdida de electrolitos en tejidos, producción de MDA (figuras 15 y 16) y mayor contenido de O₂.- (figura 14) en esta variedad que en la tolerante. La aplicación del antioxidante tiron ocasionó una reducción de un 70 % en las necrosis en los márgenes de las hojas en el tratamiento salino lo que indica que es el exceso de EROs está vinculado a la generación de tipburn. En condiciones de salinidad no se manifestaron síntomas de tipburn en hojas tratadas con DPI, mientras que en las hojas contiguas si los hubo (figura 17), sugiriendo que el O₂.- apoplástico generado por la NADPH oxidasa de membrana, podría estar involucrado en la manifestación de los síntomas.

5.2) Variedades con diversa susceptibilidad a tipburn diferirán en el control enzimático del estrés oxidativo: habrá menor expresión de tipburn en variedades con mayor actividad antioxidante.

-En la variedad tolerante Pontina, los incrementos en actividad SOD en la base de la hoja sea con salinidad como en el tratamiento con EGTA fueron mayores que en Sunstar (figura 18). Se sugirió que la actividad de esta enzima podría tener un papel importante en la tolerancia al tipburn.

4.2. Factores ambientales que inciden en la manifestación de tipburn en lechuga e integración conceptual de la salinidad y las EROs

Como se ha mencionado, son diversos los factores y las condiciones ambientales con las que se vincula al tipburn (Saure, 1998), sin embargo existe coincidencia acerca de que la participación del Ca²⁺ es fundamental durante la manifestación de síntomas. En la figura (22a), construida en base a fuentes bibliográficas, se integran los factores ambientales que influyen en la manifestación del tipburn, tanto aquéllos que promueven el crecimiento como altas intensidades lumínicas (Tibbitts y Rao, 1968; Cox et al., 1976), altas temperaturas (Misagui y Grogan, 1978; Misagui et al., 1992), elevadas concentraciones de CO₂ (Frantz et al., 2004); los que no favorecen al transporte del Ca2+ como alta humedad atmosférica (Barta y Tibbitts, 2000) así como factores que reducen el crecimiento y no favorecen la captación del Ca2+ como la alta CE en el sustrato (Beninni et al., 2003; Santos et al., 2005; Grangeiro et al., 2006), el alto contenido de NH₄⁺ (Imai, 1987; Brumm et al., 1993), la compactación y el pobre drenaje del suelo (Saure, 1998), y la salinidad. Esta última condición, según las fuentes bibliográficas, sólo origina tipburn a través de un efecto osmótico en el suelo (Sonneveld y Mook, 1983; De Pascale y Barbieri, 1995; Choi y Lee, 2001; Filgueiras et al., 2002; Cemek et al., 2011) que causa una menor captación y altera la distribución del Ca²⁺ (figura 22a).

Si bien es conocido el vínculo entre el déficit de Ca²⁺ y la generación de tipburn, no se conocían las causas por las que tal déficit lleva al síntoma. Tampoco se habían integrado la salinidad con el déficit de Ca²⁺ como elementos que confluyen en la generación de tipburn, mediados por la producción de EROs.

En base a los resultados que se obtuvieron en el presente trabajo, la salinidad no solamente afectó negativamente el crecimiento foliar sino que favoreció el aumento de EROs, vinculándose por primera vez al tipburn con el daño oxidativo resultante. También se relacionó por primera vez en lechuga la menor disponibilidad de Ca²⁺ con el incremento de EROs y consecuente generación de tipburn. Estos resultados se integran al nuevo modelo propuesto (figura 22b).

Figura 22 a. Factores ambientales que inciden en la manifestación de tipburn en lechuga (Saure, 1998; Wissemeier y Zühlke, 2002), y similar marco conceptual fue planteado para el BER en tomate (Ho y White, 2005), y b. Integración en dicho marco conceptual de la salinidad y las EROs.

a.

b.

4.3. Aspectos a considerar y perspectivas

Sonneveld y Mook (1983) encontraron un mayor contenido de Na⁺ en las hojas jóvenes que manifestaron tipburn y plantearon que el efecto del Na⁺ en la manifestación del tipburn probablemente no esté conectado directamente con la deficiencia de Ca²⁺ y propusieron que debería ser investigado el efecto del Na⁺ en la célula para dilucidar cuál fue el efecto sobre las estructuras celulares que originaron el tipburn. Desde ese entonces no existieron trabajos que aborden e intenten aclarar cuáles son los efectos directamente relacionados a la concentración de Na⁺ en hojas y que originan las necrosis; en nuestro trabajo de tesis se determinó una asociación entre el contenido de Na⁺ en hojas jóvenes y la generación de estrés oxidativo que desencadenó en el tipburn.

Los experimentos realizados caracterizaron el vínculo entre el tipburn y el estrés oxidativo. Sería conveniente considerar la participación del estrés oxidativo en la manifestación de la enfermedad cuando no existe estrés salino, por ejemplo se observó en Arabidopsis que existió un vinculo entre el estrés oxidativo con una alta intensidad lumínica (Bechtold et al., 2008) y altas temperaturas (Mittler, 2002) que originaron un incremento de EROs en cloroplasto, donde en el PSII se originó ¹O₂ y en el PSI O₂.- y H₂O₂, en ambos fotosistemas las EROs pueden originar una señal como respuesta al daño por el exceso de luz, o la muerte celular (Li et al., 2009). Se ha relacionado al tipburn con altas intensidades de luz (Tibbitts y Rao, 1968; Gaudreau et al., 1994) y con altas temperaturas (Cox et al., 1976; Yanagi et al., 1983), es probable que aumentos en las EROs estén vinculadas a la generación de tipburn en estas condiciones.

La identificación de las enzimas vinculadas a la disminución del estrés oxidativo es un punto importante con posibilidades de proveer soluciones biotecnológicas al tipburn. La lechuga pertenece al grupo de las transgénicas de segunda y tercera generación (para la producción de edulcorantes o vacunas de origen vegetal), y en la actualidad en la Argentina hay líneas de investigación que han mejorado los protocolos de transgénesis a partir de la cepa Agrobacterium LBA4404 (Radonic et al., 2011); estas herramientas biotecnológicas podrían servir para generar transgénicas con sobreexpresión de SOD y otras enzimas antioxidantes, para otorgar o incrementar la tolerancia al estrés salino y al tipburn en lechuga.

Perspectivas

-Explorar la relación del estrés oxidativo y similares respuestas con NaHCO₃, ya que dada la complejidad y el efecto diferencial en las variables de respuesta del NaHCO₃ en comparación con el NaCl, y la complejidad del estudio no fue posible abordar este aspecto, no obstante es la primera vez que se relacionó al tipburn con el estrés alcalino y al ser un problema nacional y regional quedan muchos aspectos por ser evaluados.

-A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis, se puede plantear la selección o transformación de plantas en relación a una mayor capacidad en la actividad antioxidante para incrementar la tolerancia al estrés salino y al tipburn.

-Teniendo en cuenta los resultados que indicaron que la aplicación de Ca²⁺ y antioxidantes mitigó la expresión de tipburn, se podría sugerir la aplicación de fertilizantes y compuestos de naturaleza antioxidante no tóxicos, como por ejemplo el Ca(NO₃)₂ o el ácido cítrico, como una forma de prevención del tipburn.

-Otra medida tecnológica potencialmente útil para la mitigación del tipburn sería la utilización de inoculantes, ya que se observó en lechuga que la inoculación con micorrizas arbusculares incrementó la actividad de la SOD, y otorgó tolerancia al estrés hídrico a causa de una disminución en la producción de las EROs (Ruiz-Lozano et al., 2001).

-Por último sería interesante evaluar los genotipos utilizados en el presente trabajo en condiciones de cultivo, ya que sería la prueba definitiva, en términos agronómicos, para validar los resultados que suelen ser fuertemente atenuados cuando se pasa del sistema experimental controlado a una situación en la cual el investigador ya no puede controlar las condiciones ambientales (Taleisnik et al., 2007).

Los aspectos mencionados, ameritan ser considerados en ulteriores trabajos sobre las causas de la generación y la tolerancia al tipburn en lechuga.

4.4. Bibliografía

Aktas, H.; Karni, L.; Aloni, B. y Bar-Tal, A. 2003. Physiological and biochemical mechanisms leading to blossom-end rot in greenhouse grown peppers, irrigated with saline solution. Acta Horticulturae. 609: 81-88.

Aktas, H.; Karni, L.; Chang, D.C.; Turhan, E.; Bar-Tal, A. y Aloni, B. 2005. The suppression of salinity-associated oxygen radicals production, in pepper (Capsicum annuum) fruit, by manganese, zinc, and calcium in relation to its sensitivity to blossom-end rot. Physiologia Plantarum. 123: 67-74.

Alcázar, R.; Altabella, T.; Marco, F.; Bortolotti, C.; Reymond, M.; Koncz, C.; Carrasco, P. y Tiburcio, A. 2010. Polyamines: molecules with regulatory functions in plant abiotic stress tolerance. Planta. 231(6): 1237-1249.

Al-Maskri, A.; Al-Kharusi, L. y Al-Miqbali, H. 2010. Effects of salinity stress on growth of lettuce (Lactuca sativa) under closed-recycle nutrient film technique. International Journal of Agriculture and Biology. 12: 377-380.

Aloni, B. 1986. Enhancement of leaf tipburn by restricting root growth in Chinese cabbage plants. Journal of Horticultural Science. 61: 509-513.

Alscher, R.G.; Erturk, N. y Heath L.S. 2002. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany. 53: 1331-1341.

Alvarado, D.; Carranza, F.C. y Wilhelmina, K.A. 2001. Seminario de Agro Negocios, Lechugas hidropónicas. Universidad del Pacífico, Facultad de Administración y Contabilidad. www.upbusiness.net Págs. 1-96.

Amtmann, A. y Sanders, D. 1999. Mechanisms of Na⁺ uptake by plant cells. Advances in Botanical Research. 29: 76-112.

Angelini, R.; Cona, A.; Federico, R.; Fincato, P.; Tavladoraki, P. y Tisi, A. 2010. Plant amine oxidases “on the move”: An update. Plant Physiology and Biochemistry. 48(7): 560-564.

Bais, H.P.; Vepachedu, R.; Ragan, S.G.; Callaway, M. y Vivanco, J.M. 2003. Allelopathy and Exotic Plant Invasion: From Molecules and Genes to Species Interactions. Science. 301(5638): 1377-1380.

Balcaza, L. 2003. Deterioro de los suelos cultivados bajo invernáculo. Idia XXI Nº 4. Ediciones INTA. p. 196-200.

Balcaza, L.F. 2006. Cultivo de lechuga: germinación y tipburn. Boletín Hortícola. ISSN 0328-719X, año 11, nº 32, 26-28.

Balcaza, L.F. 2010. Historia de las Hortalizas: La Lechuga. Boletín Hortícola. ISSN 0328-719X, año 15, nº 44, 43-44.

Barta, D.J. y Tibbitts, T.W. 1991. Calcium localization in lettuce leaves with and without tipburn: comparison of controlled-environment and field-grown plants. Journal of the American Society for Horticultural Science. 116: 870-875.

Barta, D.J. y Tibbitts, T.W. 2000. Calcium localization and tipburn development in lettuce leaves during early enlargement. Journal of the American Society for Horticultural Science. 125(3): 294-298.

Bartha, C.; Fodorpataki, L.; Székely, G. y Popescu, O. 2010. Physiological diversity of lettuce cultivars exposed to salinity stress. Contributii Botanice. XLV: 47-56.

Beauchamp, C. y Fridovich, I. 1971. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Analytical Biochemistry. 44: 276-287.

Bechtold, U.; Richard, O.; Zamboni, A.; Gapper, C.; Geisler, M.; Pogson, B.; Karpinski, S. y Mullineaux, P.M. 2008. Impact of chloroplastic- and extracellular-sourced ROS on high light-responsive gene expression in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 59: 121-133.

Bedard, K. y Krause, K.H. 2007. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 87: 245-313.

Beninni, E.R.Y.; Takahashi, H.W. y Neves, C.S.V.J. 2003. Manejo do cálcio em alface de cultivo hidropônico. Horticultura Brasileira, Brasília. 21(4): 605-610.

Bernstein, N; Silk, W.K. y Läuchli, A. 1993. Growth and development of sorghum leaves under conditions of NaCl stress. Spatial and temporal aspects of leaf growth inhibition. Planta. 191: 433-439.

Bernstein, N.; Shoresh, M.; Xu, Y. y Huang, B. 2010. Involvement of the plant antioxidative response in the differential growth sensitivity to salinity of leaves vs roots during cell development. Free Radical Biology and Medicine. 49(7): 1161-1171.

Bestwick, C.S.; Brown, I.R.; Bennett, M.H.R. y Mansfield, J.W. 1997. Localization of hydrogen peroxide accumulation during the hypersensitive reaction of Lettuce cells to Pseudomonas syringae pv phaseolicola. Plant Cell. 9: 209-221.

Bestwick, C.S.; Mansfield, I.R. y Mansfield, J.W. 1998. Localized changes in peroxides activity accompany hydrogen peroxide generation during the development of a nonhost hypersensitive reaction in lettuce. Plant Physiology. 118: 1067-1078.

Bie, Z.; Tadashi, I. y Shinohara, Y. 2004. Effects of sodium sulphate and sodium bicarbonate on the growth, gas exchange, and mineral composition of lettuce. Scientia Horticulturae-Amsterdam. 99: 215-224.

Blum, A. y Ebercon, A. 1981. Cell membrane stability as a measure of drought and heat tolerance in wheat. Crop Science. 21: 43-47.

Bolwell, G. P. 1992. A role for phosphorylation in the down-regulation of phenylalanine ammonia-lyase in suspension-cultured cells of french bean. Phytochemistry. 31(12): 4081-4086.

Borkowski, J. y Ostrzycka, J. 1973. The control of blossom-end rot of tomato and tipburn in lettuce by using the proper fertilization. Acta Horticulturae. (ISHS) 29: 327-340.

Bowler, C. y Fluhr, R. 2000. The role of calcium and activated oxygens as signals for controlling cross-tolerance. Trends in Plant Science. 5: 241-246.

Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72: 248-254.

Brumm, I., 1992. Einfluβ des Stickstoffangebots auf das Auftreten von Ca-Mangel bei Kopfsalat (Lactuca sativa L.). Dissertation Universität Hannover.

Brumm, I.; Schenk, M. y Gysi, C. 1993. Influence of nitrogen supply on the ocurrence of calcium deficiency in field grown lettuce. Workshop on ecological aspects of vegetable fertilization in integrated crop production in the field. Wadenswil, Switzerland. Acta Horticulturae. 339: 125-136.

Brunini, O.; Lisbão, J.B.; Bernardi, J.B.; Fornasier, J.B. y Pedro, M.J. 1976. Temperaturas básicas para alface, cultivar White Boston, em sistemas de unidades térmicas. Bragantia, Campinas. 19(35): 213-219.

Bustos, D.; Lascano, R.; Villasuso, A.L.; Machado, E.; Senn, M.E.; Cordoba, A. y Taleisnik, E. 2008. Reductions in maize root-tip elongation by salt and osmotic stress do not correlate with apoplastic O₂ •− levels. Annals of Botany. 102: 551-559.

Carter, D.R. y Cheeseman, J.M. 1993. The effects of external NaCl on thylakoid stacking in lettuce plants. Plant, Cell and Environment. 16(2): 215-222.

Cemek, B.; Ünlükara, A.; Karaman, S. y Gökalp, Z. 2011. Effects of evapotranspiration and soil salinity on some growth parameters and yield of lettuce (Lactuca sativa var. crispa). Agriculture. 98(2): 139-148.

Chaves, M.M.; Flexas, J. y Pinheiro, C. 2009. Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell. Annals of Botany. 103(4): 551-560.

Chen, W.P.; Li, P.H. y Chen, T.H.H. 2000. Glycinebetaine increases chilling tolerance and reduces chilling-induced lipid peroxidation in Zea mays L. Plant Cell and Environment. 23: 609-618.

Choi, K.Y. y Lee, Y.B. 2001. Effect of salinity of nutrient solution on growth, translocation and accumulation of ⁴⁵Ca in butterhead lettuce. Acta Horticulturae. 548: 575-580.

Claassen, M.E. y Wilcox, G.E. 1974. Comparative Reduction of Calcium and Magnesium Composition of Corn Tissue by NH₄-N and K Fertilization. Agronomy Journal. 66(4): 521-522.

Collier, G.F. y Tibbitts, T.W. 1982. Tipburn of lettuce. Horticultural Reviews. 4: 49-65.

Collier, G.F. y Huntington, V.C. 1983. The relationship between leaf growth, calcium accumulation and distribution, and tipburn development in field-grown butterhead lettuce. Scientia Horticulturae. 21: 123-128.

Collier, G.F. y Tibbitts, T.W. 1984. Effects of relative humidity and root temperature on calcium concentration and tipburn development in lettuce. Journal of the American Society for Horticultural Science. 109: 128-131.

Conn, S.J.; Gilliham, M.; Athman, A.; Schreiber, A.W.; Baumann, U.; Moller, I.; Cheng, N-H.; Stancombe, M.A.; Hirschi, K.D.; Webb, A.A.R.; Burton, R.; Kaiser, B.N.; Tyerman, S.D. y Leigha, R.A. 2011. Cell-specific vacuolar calcium storage mediated by CAX1 regulates apoplastic calcium concentration, gas exchange, and plant productivity in Arabidopsis. Plant Cell. 23: 240-257.

Corporación del Mercado Central de Buenos Aires. 2011. Información de mercado (precios y volúmenes) http://www.mercadocentral.com.ar/site2006/index.php.

Cosgrove, D.J. 1999. Enzymes and other agents that enhance cell wall extensibility. Annual Review Plant Physiology. Plant Molecular Biology. 50: 391-417.

Coulombe, B.A.; Chaney, R.L. y Wiebold, W.J. 1984. Bicarbonate directly induced iron chlorosis in susceptible soybean cultivars. Soil Science Society of America Journal. 48: 1297-1301.

Cox, E.F.; McKee, J.T.M. y Dearman, A.S. 1976. The effect of growth rate on tipburn occurrence in lettuce. Journal of Horticultural Science. 51: 297-309.

Dapoigny, L.; Fleury, A. y Robin, P. 1997. Relation entre la vitesse relative de croissance et la teneur en azote chez la laitue (Lactuca sativa L). Effets du rayonnement et de la température. Agronomie. 17: 35-41.

Davenport, R.J. y Tester, M.A. 2000. Weakly voltage-dependent, nonselective cation channel mediates toxic sodium influx in wheat. Plant Physiology. 122: 823-34.

De Pascale, S. y Barbieri, G. 1995. Effects of soil salinity from long-term irrigation with saline-sodic water on yield and quality of winter vegetable crops. Scientia Horticulturae. 64: 145-157.

Dell’Orto, M.; Santi, S.; De Nisi, P.; Cesco, S.; Varanini, Z.; Zocchi, G. y Pinton, R. 2000. Development of Fe-deficiency responses in cucumber (Cucumis sativus L.) roots: involvement of plasma membrane H⁺-ATPase activity. Journal of Experimental Botany. 51: 695-701.

Delumeau, O.; Morère-Le Paven, M.C.; Montrichard, F. y Laval-Martin, D.L. 2000. Effects of short-term NaCl stress on calmodulin transcript levels and calmodulin-dependent NAD kinase activity in two species of tomato. Plant, Cell and Environment. 23: 329-336.

Dhindsa, R.R. y Matowe, W. 1981. Drought tolerance in two mosses: correlated with enzymatic defense against lipid peroxidation. Journal of Experimetal Botany. 32: 79-91.

Di Benedetto, A. 2005. Manejo de Cultivos Hortícolas. Bases ecofisiológicas y tecnológicas. Bs. As., Orientación Gráfica Ed., p. 372.

Ehret, D. y Ho, L. 1986. Translocation of calcium in relation to tomato fruit growth. Annuals of Botany. 58: 679-788.

Eraslan, F.; Inal, A.; Savasturk, O. y Gunes, A. 2007. Changes in antioxidative system and membrane damage of lettuce in response to salinity and boron toxicity. Scientia Horticulturae. 114: 5-10.

Erickson, R.O. y Michelini, F.J. 1957. The plastochron index. American Journal Botany. 44: 297-305.

Evans, N.H.; McAinsh, M.R. y Hetherington, A.M. 2001. Calcium oscillation in higher plants. Current Opinion in Plant Biology. 4: 415-420.

Fazeli, F.; Ghorbanli, M. y Niknam, V. 2007. Effect of drought on biomass, protein content, lipid peroxidation and antioxidant enzymes in two sesame cultivars. Biologia Plantarum. 51(1): 98-103.

Fernández, G. y Johnston, M. 1986. Fisiología vegetal experimental. Servicio editorial IICA p. 397-398.

Filgueiras, R.C.; Takahashi, H.W.; Rumiko, E. y Beninni, Y. 2002. Produção de alface hidropônico em diferentes condutividades elétricas. Ciências Agrárias, Londrina. 23(2): 157-164.

Foreman, J.; Demidchik, V.; Bothwell, J.H.; Mylona, P.; Miedema, H.; Torres, M.A.; Linstead, P.; Costa, S.; Brownlee, C.; Jones, J.D. y Davies, J.M. 2003. Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth. Nature. 422: 442-446.

Foyer, C.H. y Noctor, G. 2005. Oxidant and antioxidant signalling in plants: a reevaluation of the concept of oxidative stress in a physiological context. Plant Cell and Environment. 28: 1056-1071.

Frantz, J.; Cometti, G.; Robinson, J. y Bugbee, B. 2004. Exploring the limits of crop productivity: beyond the limits of tipburn in lettuce. Journal of the American Society for Horticultural Science. 129(3): 331-338.

Fry, S.C.; Dumville, J.C. y Miller, J.G. 2001. Fingerprinting of polysaccharides attacked by hydroxyl radicals in vitro and in the cell walls of ripening pear fruit. Biochemistry Journal. 357: 729-737.

Gallego, S.; Benavides, M. y Tomaro, M. 1996. Effect of heavy metal ion excess on sunflower leaves: evidence for involvement of oxidative stress. Plant Science. 121: 151-159.

Gaudreau, L.; Charbonneau, J.; Vezina, L.P. y Gosselin, A. 1994. Photoperiodic and photosynthetic photon flux influence growth and quality of greenhouse-grown lettuce. HortScience. 29: 1285-1289.

Gill, S.S. y Tuteja, N. 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry. 48: 909-930.

Gilliham, M.; Dayod, M.; Hocking, B.J.; Simon, J.C.; Xu, B.; Conn, S.J.; Kaiser, B.N.; Leigh, R.A. y Tyerman, S.D. 2011. Calcium delivery and storage in plant leaves: exploring the link with water flow. Journal of Experimental Botany. 62(7): 2233-2250.

Goto, E. y Takakura, T. 2003. Reduction of lettuce tipburn by shortening day/night cycle. Journal of Agricultural Meteorology. 59: 219-225.

Grangeiro, L.C.; Costa, K.R.; Medeiros, M.A.; Salviano, A.M.; Negreiros, M.Z.; Becerra Neto, F. y Oliveira, S.L. 2006. Acúmulo de nutrientes por três cultivares de alface cultivadas em condições do Semi-Árido. Horticultura Brasileira. 24: 190-194.

Grazia, J.; de Tittonell, P.A. y Chiesa, A. 2001. Efecto de la época de siembra, radiación y nutrición nitrogenada sobre el patrón de crecimiento y el rendimiento del cultivo de lechuga (Lactuca sativa L.). Investigación Agraria. Producción y Protección de Vegetales. 16(3): 355-365.

Grégoire, H.C.; Siliquini, O.A.; Vergara, G.; Ramos, J.J. y Sarría, L. 2001. Evaluación de cultivares de lechuga (Lactuca sativa L.) en invernaderos de La Pampa en dos épocas de siembra. Actas del XXIV Congreso Argentino de Horticultura, San Salvador de Jujuy. Horticultura Argentina. v. 20. nº 48.

Gueta-Dahan, Y.; Yaniv, Z.; Zilinskas, B.A. y Ben-Hayyim, G. 1997. Salt and oxidative stress: similar and specific responses and their relation to salt tolerance in Citrus. Planta. 203: 460-469.

Hagar, H.; Ueda, N. y Shal, S.V. 1996. Role of reactive oxygen metabolites in DNA damage and cell death in chemical hypoxic injury LLC-PK1 cells. American Journal of Physiology. 271: 209-215.

Han, H.S. y Lee, K.D. 2005. Plant Growth Promoting Rhizobacteria Effect on Antioxidant Status, Photosynthesis, Mineral Uptake and Growth of Lettuce under Soil Salinity. Research Journal of Agriculture and Biological Sciences. 1(3): 210-215.

Hartz, T.K.; Johnstone, P.R.; Smith, R.F. y Cahn, M.D. 2007. Soil calcium status unrelated to tipburn of romaine lettuce. HortScience. 42: 1681-1684.

Hasegawa, P.M.; Bressan, R.A.; Zhu, J.K. y Bohnert, H.J. 2000. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51: 463-499.

Hayes, R.J. 2006. Variation for tipburn resistance in lettuce. HortScience. 40: 990-991.

Heath, R.L. y Parker, L. 1968. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives of Biochemistry and Biophysics. 125: 189-198.

Hernández, J.A.; Corpas, F.J.; Gómez, M.; Del Río, L.A. y Sevilla, F. 1993. Salt-induced oxidative stress mediated by activated oxygen species in pea leaf mitochondria. Physiologia Plantarum. 89: 103-110.

Hernández, J.A.; Olmos, E.; Corpas, F.J.; Sevilla, F. y del Rio, L.A. 1995. Salt induced oxidative stress in chloroplast of pea plants. Plant Science. 105: 151-167.

Hernández, J.; Jimenez, A.; Mullineaux, P. y Sevilla, F. 2000. Tolerance of pea plants (Pisum sativum) to long-term salt stress is associated with induction of antioxidant defences. Plant Cell and Environmet. 23: 853-862.

Hernández, J.A.; Ferrer, M.A.; Jiménez, A.; Barceló, A.R. y Sevilla, F. 2001. Antioxidant systems and O₂.-/H₂O₂ production in the apoplast of pea leaves. Its relation with salt-induced necrotic lesions in minor veins. Plant Physiology. 127: 817-31.

Hernández, J.A.; Aguilar, A.; Portillo, B.; López-Gómez, E.; Mataix Beneyto, J. y García-Legaz, M.F. 2003. The effect of calcium on the antioxidant enzymes from salt-treated loquat and anger plants. Functional Plant Biology. 30: 1127-1137.

Hirschi, K.D. 2001. Vacuolar H⁺/Ca²⁺ transport: who’s directing the traffic? Trends in Plant Science. 6(3): 100-104.

Hirschi, K.D. 2004. The Calcium Conundrum. Both Versatile Nutrient and Specific Signal. Plant Physiology. 136: 2438-2442.

Ho, L.C.; Belda, R.; Brown, M.; Andrews, J. y Adams, P. 1993. Uptake and transport of calcium and the possible causes of blossom-end rot in tomato. Journal of Experimental Botany. 44: 509-518.

Ho, L.C. y White, P.J. 2005. A cellular hypothesis for the induction of Blossom-End Rot in tomato fruit. Annals of Botany. 95: 571-581.

Hodges, D.M. y Nozzolillo, C. 1996. Anthocyanin and anthocyanoplast content of cruciferous seedlings subjected to mineral nutrient deficiencies. Journal of Plant Physiology. 147: 749-754.

Holtschulze, M. 2005. Evaluation of head lettuce genotypes for susceptibility to Tipburn under controlled environmental conditions. Diese dissertation ist auf dem Hochschulschriften server der ULB Bonn http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online elektronisch publiziert.

Hopkins, W.G. 1995. Introduction to plant physiology, second edition. John Wiley & Sons, New York, NY.

Huett, D.O. 1994. Growth, nutrient uptake and tipburn severity of hydroponic lettuce in response to electrical conductivity and K:Ca ratio in solution. Australian Journal of Agricultural Research. 45(1): 251-267.

Imai, H. 1987. NH₄-N toxicity and calcium deficiency in tipburn and internal rot in Chinese cabbage, In: Proceedings of a seminar on improved vegetable production in Asia, FFTC/ASPAC Book Series nº 36, Taipei, p. 21-48.

ISTA. International Rules for Seed Testing. International seed testing Association (1996). Seed Sci. & Technol., 24, Supplement. p. 180.

James, R.A; Davenport, R.J. y Munns, R. 2006. Physiological Characterization of Two Genes for Na⁺ Exclusion in Durum Wheat, Nax1 and Nax2. Plant Physiology. 142: 1537-1547.

Jenni, S. y Yan, W. 2009. Genotype by environment interactions of heat stress disorder resistance in crisphead lettuce. Plant Breeding. 128: 374-380.

Jenni, S. y Hayes, R. 2010. Genetic variation, genotype × environment interaction, and selection for tipburn resistance in lettuce in multi-environments. Euphytica. 171(3): 427-439.

Jiang, M. y Zhang, J. 2001. Effect of abscisic acid on active oxygen species, antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of maize seedlings. Plant and Cell Physiology. 42: 1265-1273.

Kawano, T. y Muto, S. 2000. Mechanism of peroxidase actions for salicylic acid induced generation of active oxygen species and an increase in cytosolic calcium in tobacco cell suspension culture. Journal of Experimental Botany. 51(345): 685-693.

Khazaei, M.; Moien-Afshari, F.; Elmi, S.; Mirdamadi, A. y Laher, I. 2009. The effects of diethyldithiocarbamate, a SOD inhibitor, on endothelial function in sedentary and exercised db/db mice. Pathophysiology. 16(1): 15-18.

Kleemann, M. 2000. Factors affecting calcium deficiency related disorders in vegetables. Proceedings of the International Conference: Development of environmentally friendly plant protection in the Baltic Region p. 67-69.

Koontz, H.V. y Prince, R.P. 1986. Effect of 16 and 24 hours daily radiation (light) on lettuce growth. HortScience. 21: 123-124.

Koyama, R.; Sanada, M.; Itoh, H.; Kanechi, M.; Inagaki, N. y Uno, Y. 2011. In vitro evaluation of tipburn resistance in lettuce (Lactuca sativa. L). Plant Cell, Tissue and Organ Culture: In press. DOI 10.1007/s11240-011-0033-5

Lavado, R.S. y Taboada, M.A. 2009. Alteraciones de la fertilidad del suelo causadas por halomorfismo. En: Taboada M.A. y Lavado R.S. (Ed.). Alteraciones de la fertilidad en suelos. El halomorfismo, la acidez y las inundaciones. Editorial FAUBA, Buenos Aires. 1-41.

Lazof, D.B. y Cheeseman, J.M. 1988. Sodium and potassium compartmentation and transport in the roots of intact lettuce plants. Plant Physiology. 88: 1279-1284.

Lazof, D.B.; Bernstein, N. y Lauchli, A. 1991. Growth and development of the Lactuca sativa shoot as affected by NaCl stress: consideration of leaf developmental stages. Botanical Gazette. 152: 72-76.

Lazof, D.B.; Bernstein, N. y Lauchli, A. 1998. The NaCl Induced Inhibition of Shoot Growth: The Case for Disturbed Nutrition with Special Consideration of Calcium. Advances in Botanical Research. 29: 113-189.

Lazof, D.B. y Bernstein, N. 1999. Effects of salinization on nutrient transport to lettuce leaves: consideration of leaf developmental stage. New Phytologist. 144(1): 85-94.

Lebeda, A.; Doležalová, I.; Křístková, E.; Dehmer, K.J.; Astley, D.; van de Wiel, C.C.M. y van Treuren, R. 2007. Acquisition and ecological characterization of Lactuca serriola L. germplasm collected in the Czech Republic, Germany, the Netherlands and United Kingdom. Genetic Resources and Crop Evolution. 54(3): 555-562.

Levine, A.; Tenhaken, R.; Dixon, R. y Lamb, C. 1994. H₂O₂ from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease response. Cell. 79: 583-93.

Li, Z.; Wakao, S.; Fischer, B.B. y Niyogi, K.K. 2009. Sensing and responding to excess light. Annual Review of Plant Biology. 60: 239-60.

Llorach, R.; Martínez-Sánchez, A.; Tomás-Barberín, F.A.; Gil, M.I. y Ferreres, F. 2008. Characterization of polyphenols and antioxidant properties of five lettuce varieties and escarole. Food Chemistry. 108: 1028-1038.

Lopez, N.; Trotz, P.; González, C.; Radonic, L.; Benavides, P. y Lopez Bilbao M. 2011. Análisis exploratorio de la respuesta de 12 variedades de lechuga en respuesta al riego con NaCl 50 mM. Libro de resúmenes XXXIV Congreso Argentino de Horticultura ISBN 978-987-97812-8-9. p 311.

M’Sehli, W.; Youssfi, S.; Donnini, S.; Dell’Orto, M.; De Nisi, P.; Zocchi, G.; Abdelly, C. y Gharsalli, M. 2008. Root exudation and rhizosphere acidification by two lines of Medicago ciliaris in response to lime-induced iron deficiency. Plant Soil. 312: 151-62.

Maas, E.V. 1986. Salt tolerance of plants. Applied Agricultural Research. 1: 12-26.

Maathuis, F.J.M. y Amtmann, A. 1999. K+ Nutrition and Na+ Toxicity: The Basis of Cellular K⁺/Na+ Ratios. Annals of Botany. 84(2): 123-133.

Marschner, H. 1995. Mineral Nutrition of Higher Plants. San Diego: Academic Press.

Martínez, V.; Bernstein, N. y Laüchli, A. 1996. Salt-induced inhibition of phosphorus transport in lettuce plants. Physiologia Plantarum. 97: 118-122.

Matysik, J.; Alia, B.B. y Mohanty, P. 2002. Molecular mechanism of quenching of reactive oxygen species by proline under stress in plants. Current Science. 82: 525-532.

Maynard, D.N. y Barker, A.V. 1972. Internal browning in Brussels sprouts: a calcium deficiency disorder. Journal of the American Society for Horticultural Science. 97: 789-792.

Maynard, D.N. 1979. Nutritional disorders of vegetable crops. A review. Journal of Plant Nutrition. 1: 1-23.

Mengel, K. y Geurtzen, G. 1986. Iron chlorosis on calcareous soils. Alkaline nutritional condition as the cause for the chlorosis. Journal of Plant Nutrition 9(3-7): 161-173.

Mhamdi, A.; Hager, J.; Chaouch, S.; Queval, G.; Han, Y.; Taconnat, L.; Saindrenan, P.; Gouia, H.; Issakidis-Bourguet, E.; Renou, J.P. y Noctor, G. 2010. Arabidopsis Glutathhione reductase1 Plays a Crucial Role in Leaf Responses to Intracellular Hydrogen Peroxide and in Ensuring Appropriate Gene Expression through Both Salicylic Acid and Jasmonic Acid Signaling Pathways. Plant Physiology. 153: 1144-1160.

Miller, G.A.D.; Suzuki, N.; Ciftci-Yilmaz, S. y Mittler, R. 2010. Reactive oxygen species homeostasis and signalling during drought and salinity stresses. Plant, Cell and Environment. 33: 453-67.

Misaghi, I.J. y Grogan, R.G. 1978. Effect of temperature on tipburn development in head lettuce. Phytopathology. 68: 1738-1743.

Misaghi, I.J.; Matyak, C.A. y Grogan, R.G. 1981. Soil and foliar application of calcium chloride and calcium nitrate to control tipburn of head lettuce. Plant Disease. 65: 821-822.

Misaghi, I.J.; Oebker, N.F. y Hine, R.B. 1992. Prevention of tipburn in iceberg lettuce during postharvest storage. Plant Disease. 76: 1169-1171.

Mittler, R. 2002. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends in Plant Science. 7(9): 405-410.

Mittler, R.; Vanderauwera, S.; Gollery, M. y Van Breusegem, F. 2004. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9: 490-496.

Moller, I.M.; Jensen, P.E. y Hansson, A. 2007. Oxidative modifications to cellular components in plants. Annual Review of Plant Biology. 58: 459-481.

Munns, R. y Termaat, A. 1986. Whole-Plant Responses to Salinity. Australian Journal of Plant Physiology. 13(1): 143-160.

Munns, R. 1993. Physiological processes limiting plant growth in saline soil: some dogmas and hypotheses. Plant, Cell and Environment. 16: 15-24.

Munns, R. 2002. Comparative physiology of salt and water stress. Plant Cell and Environment. 25(2): 239-250.

Munns, R. 2005. Genes and salt tolerance: bringing them together. New Phytologist. 167: 645-663.

Munns, R.; James, R.A. y Laüchli, A. 2006. Approaches to increasing the salt tolerance of wheat and other cereals. Journal of Experimental Botany. 57: 1025-1043.

Munns, R. y Tester, M. 2008. Mechanisms of Salinity Tolerance. Annual Review of Plant Biology. 59: 651-81.

Nakano, Y. y Asada, K. 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant and Cell Physiology. 22: 867-880.

Ogawa, K.; Kanematsu, S. y Asada, K. 1997. Generation of superoxide anion and localization of Cu Zn-superoxide dismutase in the vascular tissue of spinach hypocotyls: Their association with lignification. Plant and Cell Physiology. 38: 1118-1126.

Oh, M-M.; Trick, H.N. y Rajashekar, C.B. 2009. Secondary metabolism and antioxidants are involved in environmental adaptation and stress tolerance in lettuce. Journal of Plant Physiology. 166: 180-191.

Orr, W.C. y Sohal, R.S. 1994. Extension of life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster. Science. 263: 1128-1130.

Ottone, M. 2009. SAGPYA. Gacetilla Informativa del Sector Agroalimentario Nro. 47 disponible en www.sagpya.mecon.gov.ar/dimeagro.

Ozgen, S. y Sekerci, S. 2011. Effect of leaf position on the distribution of phytochemicals and antioxidant capacity among green and red lettuce cultivars. Spanish Journal of Agricultural Research. 9(3): 801-809.

Parekh, A. y Putney, J. 2005. Store-Operated Calcium Channels. Physiological reviews. 85: 757-810.

Parida, A.K.; Das, A.B.; Mittra, B. y Mohanty, P. 2004.Salt-stress induced alterations in protein profile and protease activity in the mangrove, Bruguiera parviflora. Z. Naturforsch. 59: 408-414.

Pereira, C.; Junqueira, A.M. y Oliveira, S.A. 2005. Balanço nutricional e incidência de queima de bordos em alface produzida em sistema hidropônico– NFT. Horticultura Brasileira. 23(3): 810-814.

Piqueras, A.; Hernández, J.A.; Olmos, E.; Hellín, E. y Sevilla, F. 1996. Changes in antioxidant enzymes and organic solutes associated with adaptation of citrus cells to salt stress. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 45(1): 53-60.

Pitzer, K.S. 1977. Electrolyte theory - improvements since Debye and Hueckel. Accounts of Chemical Research. 10(10): 371-377.

Pressman, E.; Shaked, R. y Arcan, L. 1993. The effect of flower-inducing factors on leaf Tipburn formation in Chinese cabbage. Journal of Plant Physiology. 141: 210-214.

Radonic, L.M.; Lopez, N.E.; Hopp, H.E. y Lopez Bilbao, M. 2011. Protocolo de transformación genética de lechuga var. Grand Rapids. Libro de resúmenes XXXIV Congreso Argentino de Horticultura ISBN 978-987-97812-8-9. p 310.

Reinaudi, N.B.; Viñuela, R.; Rosieri, J.; Nadal, D. y Grégoire, H.C. 2000. Calidad del agua para riego en invernáculos de la región central de La Pampa. Actas XVIII Congreso Nacional del Agua. Santiago del Estero.

Ren, Z.H.; Gao, J.P.; Li, L.G.; Cai, X.L.; Huang, W.; Chao, D.Y.; Zhu, M.Z.; Wang, Z.Y.; Luan, S. y Lin, H.X. 2005. A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter. Nature Genetics. 37: 1141-1146.

Rhoades, J.D.; Manteghi, N.A.; Shouse, P.J. y Alves, W.J. 1989. Soil electrical conductivity and soil salinity: new formulations and calibrations. Soil Science Society of America Journal. 53: 433-439.

Richards, L.A. 1977. Diagnostico y rehabilitación de suelos salinos y sódicos. Editorial Limusa. México.

Rivero, R.M.; Kojima, M.; Gepstein, A.; Sakakibara, H.; Mittler, R.; Gepstein, S. y Blumwald, E. 2007. Delayed leaf senescence induces extreme drought tolerance in a flowering plant. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104(49): 19631-19636.

Rodríguez, A.; Grunberg, K. y Taleisnik, E. 2002. Reactive oxygen species in the elongation zone of maize leaves are necessary for leaf extension. Plant Physiology. 129: 1627-1632.

Rodríguez, A.; Ortega, L.; Córdoba, A. y Taleisnik, E. 2004. Decreased reactive oxygen species concentration in the elongation zone contributes to the reduction in maize leaf growth under salinity. Journal of Experimental Botany. 53: 1383-1390.

Rodríguez, A.; Lascano, H.R.; Bustos, L. y Taleisnik, E. 2007. Salinity-induced reductions in NADPH oxidase activity in the maize leaf blade elongation zone. Journal of Plant Physiology. 164: 223-230.

Rosen, C.J. 1990. Leaf tipburn in cauliflower as affected by cultivar, calcium sprays, and nitrogen nutrition. HortScience. 25: 660-663.

Rubio, J.S.; García-Sánchez, F.; Rubio, F. y Martínez, V. 2009. Yield, blossom-end rot incidence, and fruit quality in pepper plants under moderate salinity are affected by K⁺ and Ca2+ fertilization. Scientia Horticulturae. 119(2): 79-87.

Ruiz-Lozano, J.M.; Collados, C.; Barea, J.M. y Azcón, R. 2001. Clonig of cDNAs encoding SODs from lettuce plants which show differential regulation by arbuscular mycorhizal symbiosis and by drought stress. Journal of Experimental Botany. 52: 2241-2242.

Ryder, E.J. 1986. Lettuce breeding. In: Basset M. (ed.), Breeding Vegetable Crops. Westport, AVI Publishing Co. 433-474.

Sanders, D.; Pelloux, J.; Brownlee, C. y Harper, J. 2002. Calcium at the Crossroads of Signaling. The Plant Cell. 14: S401-S417.

Santos, J.E.; Luz, J.M.Q.; Furlani, P.R.; Martins, S.T.; Haber, L.L. y Lana, R.M.Q. 2005. Diferentes concentrações de solução nutritiva para a cultura da alfavaca em sistema de cultivo hidropônico. Bioscience Journal, Uberlândia. 21(2): 21-24.

Saure, M.C. 1998. Causes of the tipburn disorder in leaves of vegetables. Scientia Horticulturae. 76: 131-147.

Saure, M.C. 2001. Blossom-end rot of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) -a calcium- or a stress-related disorder? Scientia Horticulturae. 90(3-4): 193-208.

Scandalios, J. 1993. Oxygen stress and superoxide dismutases. Plant Physiology. 101: 7-12.

Schmitz-Eiberger, M.; Haefs, R. y Noga, G. 2002. Calcium deficiency - Influence on the antioxidative defense system in tomato plants. Journal of Plant Physiology. 159(7): 733-742.

Schopfer, P.; Plachy, C. y Frahry, G. 2001. Release of reactive oxygen intermediates (superoxide radicals, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals) and peroxidase in germinating radish seeds controlled by light, gibberellin, and abscisic acid. Plant Physiology. 125: 1591-1602.

Shi, D.C. y Yin, L.J. 1993. Difference between salt (NaCl) and alkaline (Na₂CO₃) stresses on Puccinellia tenuiflora (Griseb.) Scribn et Merr. plants. Acta Botanica Sinica-Chinese. 3: 144-149.

Shi, H.; Ishitani, M.; Kim, C. y Zhu, J.K. 2000. The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na⁺/K+ antiporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97: 6896-6901.

Shi, H.; Quintero, F.J.; Prado, J.M. y Zhu, J.K. 2002. The putative plasma membrane Na⁺-H⁺ antiporter SOS1 controls long distance Na⁺ transport in plants. The Plant Cell. 14: 465-477.

Sjölin, A.M. y Møller, I.M. 1991. The effect of polyamines and other cations on NADH oxidation on the inner surface of the inner mitochondrial membrane. Plant Physiology and Biochemistry. 29: 607-613.

Sonneveld, C. y Van Beusekom, J. 1974. The effect of saline irrigation water on some vegetables under glass. Acta Horticulturae. 35: 75-85.

Sonneveld, C. y Mook, E. 1983. Lettuce tipburn as related to the cation contents of different plant parts. Plant and Soil. 75(1): 29-40.

Sullivan, C.Y. 1972. Mechanisms of heat and drought resistance in grain sorghum and methods of measurements. In Sorghum in the seventies. Oxford and IBH Publishing Co, New Delhi, India. 247-264.

Suzuki, N.; Miller, G.; Morales, J.; Shulaev, V.; Torres, M.A. y Mittler, R. 2011. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. doi:10.1016/j.pbi.2011.07.014.

Taleisnik, E. y Grunberg, K. 1994. Ion balance in tomato cultivars differing in salt tolerance. I. Sodium and potassium accumulation and fluxes under moderate salinity. Physiologia Plantarum. 92(3): 528-534.

Taleisnik, E.; Grunberg, K. y Santa Maria, G. 2007. La salinización de suelos en la Argentina: su impacto en la producción agropecuaria. EDUCC. 118 pp. ISBN 978-987-626-013-8.

Tan, Y-F.; O'Toole, N.; Taylor, N.L. y Millar, A.H. 2010. Divalent Metal Ions in Plant Mitochondria and Their Role in Interactions with Proteins and Oxidative Stress-Induced Damage to Respiratory Function. Plant Physiology. 152(2): 747-761.

Tesi, R.; Lenzi, A. y Lombardi, P. 2003. Effect of salinity and oxygen level on lettuce grown in a floating system. Acta Horticulturae. 609: 383-387.

Tester, M. y Davenport, R. 2003. Na⁺ Tolerance and Na⁺ Transport in Higher Plants. Annals of Botany. 91(5): 503-527.

Thicoïpé, J.P. 1997. Laitues. ISBN 2-87911-102-1. p. 281.

Thompson, R.C. 1926. Tipburn of Lettuce. Colorado Agricultural Experimental Station Bull. 311: 1-31.

Thorsten, J. 1999. Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals. Biochemical Pharmacology. 57(3): 231-245.

Tibbitts, T.W. y Rao, R.R., 1968. Light intensity and duration in the development of lettuce tipburn. Proceedings of the American Society for Horticultural Science. 93: 454-461.

Tibbitts, T.W. y Palzkill, D.A. 1979. Requirement for root pressure flow to provide adequate calcium to low transpiring tissue. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 10(1-2): 251-257.

Tzortzakis, N.G. 2008. Influence of NaCl and Calcium Nitrate on Lettuce and Endive Growth Using Nutrient Film Technique. International Journal of Vegetable Science. 15(1): 44-56.

Tzortzakis, N.G. 2009. Alleviation of Salinity-Induced Stress in Lettuce Growth by Potassium Sulphate Using Nutrient Film Technique. International Journal of Vegetable Science. 15(3): 226-239.

Tzortzakis, N.G. 2010. Potassium and calcium enrichment alleviate salinity-induced stress in hydroponically grown endives. Horticultural Science – UZEI. 37(4): 155-162.

Vranova, E.; Inze, D. y Van Breusegem, F. 2002. Signal transduction during oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 53(372): 1227-1236.

White, P.J. 2001. The pathways of calcium movement to the xylem. Journal of Experimental Botany. 52(358): 891-899.

White, P.J. y Broadley, M.R. 2003. Calcium in plants. Annals of Botany. 92: 487-511.

Wissemeier, A.H. 1996. Calcium-Mangel bei Salat (Lactuca sativa L.) und Poinsettie (Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch): Einfluß von Genotyp und Umwelt. Verlag Ulrich E. Grauer, Stuttgart, p. 299.

Wissemeier, A.H. y Zuhlke, G. 2002. Relationship between climatic variables, growth and the incidence of tipburn in field-grown lettuce as evaluated by simple, partial and multiple regression analysis. Scientia Horticulturae. 93(3/4): 193-204.

Xie, Y-J.; Xu, S.; Han, B.; Wu, M-Z.; Yuan, X-X.; Han, Y.; Gu, Q.; Xu, D-K.; Yang, Q. y Shen, W-B. 2011. Evidence of Arabidopsis salt acclimation induced by upregulation of HY1 and the regulatory role of RbohD-derived reactive oxygen species synthesis. Plant Journal. 66: 280-92.

Yan, B.; Dai, Q.; Liu, X.; Huang, S. y Wang, Z. 1996. Flooding-induced membrane damage, lipid oxidation and activated oxygen generation in corn leaves. Plant Soil. 179: 261-268.

Yanagi, A.A.; Bullock, R.M. y Cho, J.J. 1983. Factors involved in the development of tipburn in crisphead lettuce in Hawaii. Journal of the American Society for Horticultural Science. 108: 234-237.

Yang, C.; Wang, P.; Li, C.; Shi, D. y Wang, D. 2008a. Comparison of effects of salt and alkali stresses on the growth and photosynthesis of wheat. Photosynthetica. 46(1): 107-114.

Yang, C.; Shi, D. y Wang, D. 2008b. Comparative effects of salt stress and alkali stress on growth, osmotic adjustment and ionic balance of an alkali resistant halophyte Suaeda glauca (Bge). Plant Growth Regulation. 56: 179-190.

Yun, H.S.; Kwon, C.; Kim, T.W.; Joo, S.H.; Cho, M.H.; Kang, B.G.; Chang, S.C. y Kim, S.K. 2007. Regulation of VrXTH1 Expression in Mungbean. Journal of Plant Biology. 50: 65-69.

Zhu, J.K. 2000. Genetic analysis of plant salt tolerance using Arabidopsis. Plant Physiology. 124: 941-948.

4.5. Apéndice

Figura 1: A. Conductividad eléctrica y B. pH en la solución nutritiva Hoagland al 50 %, y con el agregado de NaHCO₃ 10 mM y NaCl 50 mM en función de la acumulación de grados día.

A.

B.

Los resultados corresponden desde el tercer hasta el sexto ensayo, donde se utilizaron las variedades Sunstar, Pontina, Divina y Prima (n=4), las barras indican ± error estándar. Las mediciones se tomaron a las 16 h del cambio de la solución nutritiva.

Figura 2: Efecto de la aplicación tópica de antioxidantes en la expresión de tipburn en los tratamientos con 50 mM NaCl en la variedad Sunstar.

Síntomas evaluados en la hoja 17, 24 h posteriores a la aplicación de antioxidantes en el margen de la hoja. (a) tratada con 50 µM de DPI. Las hojas 19-21 de la misma planta no fueron tratadas y desarrollaron síntomas. (b) tratada con 50 mM de tiron. Datos promedio ± error estándar (n=6). Letras distintas indican diferencias significativas (p≤ 0,05). Test DMS.

Figura 3: Actividad de SOD en geles de poliacrilamida transformados en escala de grises (a-b-c) en función de los tratamientos.

Calle 1: control, calle 2: control + EGTA (50 mM), calle 3: NaCl (50 mM) y calle 4: NaCl (50 mM) + EGTA (50 mM); a. sin inhibidor, b. con H₂O₂ (5 mM) como inhibidor de las isoformas CuZn-SOD y Fe-SOD; y c. con KCN (5 mM) como inhibidor de la isoforma CuZn-SOD en los márgenes de la base en la hoja 17 a un PI cercano a 21,5 en lechuga de la variedad Sunstar.